Pharmacologie Moléculaire 2

Présentation au sujet: "Pharmacologie Moléculaire 2"— Transcription de la présentation:

1 Pharmacologie Moléculaire 2
Magali Waelbroeck E

2 But du cours: Vous permettre de comprendre, au vu des figures dans un article, pourquoi l’expérience a été faite et quelle conclusion on peut en tirer. 43 SLIDES

3 Moyens: Apprendre à traduire une description (phrase) en modèle (équation stoechiométrique), en déduire les prévisions vérifiables, et en vérifier la validité thermodynamique. Chercher vous-mêmes la réponse à quelques questions… 43 SLIDES

4 Outils utilisés dans ce cours:
Programmes: Graph Pad: utilisation et interprétation des données expérimentales ou simulées. Commentaires: voir Spdbv ou Deep View: visualisation des structures protéiques téléchargées de la Protein Data Bank. Utilisation: voir le “tutorial” de Gale Rhodes Excell: simulation de résultats attendus 43 SLIDES

5 Voici quatre représentations d’une même protéine
Voici quatre représentations d’une même protéine. Sur lesquelles peut on voir: Le tracé de la chaine polypeptidique? Les liens Hydrogènes qui stabilisent la structure? Le volume occupé réellement par la protéine? Les chaines latérales des acides aminés? Le type d’acide aminé (Basique, acide, hdrophobe, polaire)? La structure primaire? Secondaire? Tertiaire? Quaternaire? La position du ou des ligands? 43 SLIDES

6 A B D C 43 SLIDES

7 Quelles sont les relations entre affinité et cinétiques?
Définition du terme “affinité” Qu’est-ce qui permet ou explique une liaison de forte affinité? Définition du terme “spécificité” Pourquoi dit-on qu’un enzyme, un récepteur, un ligand est très spécifique de… Définition du terme “cinétique” Qu’est-ce qui explique une liaison rapide ou lente? Une dissociation rapide ou lente? 43 SLIDES

8 Thermodynamique: Energie Libre R+D R.D Chemin réactionnel 43 SLIDES

9 Thermodynamique: Energie Libre R+D R.D Chemin réactionnel 43 SLIDES

10 Collisions: Phase aqueuse, T° pièce :
Collisions: 1010 M-1sec ≈1011M-1min-1 Protéines: peu de collisions productives: kon typiques: petites molécules: M-1min-1 protéine-protéine: 105 M-1min-1 43 SLIDES

11 Relations vitesse - affinité?
Hypothèse: association reflète probabilité collisions ligand -récepteur Vitesse association constante, Dissociation lente  haute affinité; dissociation rapide  basse affinité KD proportionnelle à koff 43 SLIDES

12 Vérification: mesure du kon de différents couples ligand - récepteurs
Trop petits: pas visibles. Échelle log? 43 SLIDES

13 kon : comparaison de différents ligands, différents récepteurs
3 logs: 1000 x Conclusion: kon très variable: notre hypothèse était fausse. Pourquoi? 43 SLIDES

14 Premier indice: comparaison de la vitesse d’association d’énantiomères
R β-adrenergique kon (108M-1min-1) koff (min-1) pKD t1/2 (min) (-) pindolol 6.9 0.546 9.10 1.27 (+) pindolol 6.6 18.97 7.54 0.4 (-)CGP 12177 2.2 0.024 9.97 28.9 (+)CGP 12177 4.2 0.57 7.86 0.12 (-)ICYP 14.0 0.0025 11.75 277.3 (+)ICYP 17.0 0.488 9.54 1.4 (-)carazolol 7.4 11.47 277 (+)carasolol 3.4 0.085 9.6 8.2 (-)IHYP 11.0 0.0021 11.72 330 (+)IHYP 5.8 0.042 10.14 16.5 43 SLIDES

15 kon koff pKD t1/2 (min) (108M-1min-1) (min-1) Muscarinique (M2)
(R)-QNB 1.0 0.0092 10.0 75 (S)-QNB 1.1 0.6 8.3 1.2 (R)-Met QNB 2.6 0.11 9.4 6.3 (S)-Met QNB 5.8 0.25 2.8 Muscarinique (M3) <<0.0009 <<10.0 >>360 0.10 8.0 0.23 0.015 9.2 46 0.50 0.2 8.4 3.5 43 SLIDES

16 Données à expliquer: kon dépend (un peu) du ligand,
kon dépend (beaucoup) du récepteur, kon presque identique si énantiomères, koff détermine l’affinité relative des énantiomères… 43 SLIDES

17 Kinetic Tuning of the EF-Hand Calcium Binding Motif: The Gateway Residue Independently Adjusts (i) Barrier Height and (ii) Equilibrium   Steven K. Drake and Joseph J. Falke* Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado Biochemistry, 35 (6), , 1996. Abstract: In EF-hand calcium binding sites of known structure, the side chain provided by the ninth EF-loop position lies at the entrance of the shortest pathway connecting the metal binding cavity to solvent. The location of this residue suggests that it could serve as a "gateway", providing steric and electrostatic control over the kinetics of Ca2+ binding and dissociation. 43 SLIDES

18 Galactose Binding Protein:
Ca2+ Galactose 43 SLIDES

19 Galactose binding protein: E-F Hand (« main E-F »)
« index » Ca+2 « pouce » Asp Lys (groupe C=O chaine polypeptidique) Asp Asn Ca+2 Asn « paume » 43 SLIDES

20 To test this hypothesis, the present study has engineered the putative gateway side chain of a model EF-hand site and determined the resulting effects on metal ion affinity and dissociation kinetics. The model site chosen was that of the Escherichia coli galactose binding protein (GBP), in which the putative gateway is a Gln side chain. 43 SLIDES

21 Galactose binding protein: Calcium binding site
Calcium binding E-F Hand (gate closed) Calcium binding E-F Hand (gate open) « Gate » « Gate » Gln « gate keeper » Gln « gate keeper » 43 SLIDES

22 Two control substitutions at the fourth EF-loop position, a noncoordinating surface residue, had no significant effect on either the equilibrium or the kinetics of the model site. The remaining seven proteins, which possessed unique substitutions at the ninth EF-loop position (Glu, Asn, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala), in each case significantly altered the affinity or dissociation kinetics of the site for Tb3+, used as a probe metal ion. 43 SLIDES

23 Fluorescence? Lumière = Énergie:
1 Einstein = 1 mol de photons 1 kcal = 4,1868 kJ 43 SLIDES

24 Rappel: orbitales liantes et antiliantes
( ou  ) 1* 1p 1p * Energie 1 2* 2s 2s * 2 43 SLIDES

25 Fluorescence, phosphorescence
Fluorescence: réémission de lumière immédiate; Phosphorescence: isomérisation du spin des e-: réémission lente. 43 SLIDES

26 FRET Excitation - - - - Emission ________ Donneur Accepteur λ (nm)
L’énergie dégagée par le donneur est absorbée directement par l’accepteur, puis réémise sous forme de photons de plus longue λ 43 SLIDES

27 3 Tryptophanes (accepteurs) (fluorescents) à 10-20 Å du Tb3+
Terbium (donneur) phosphorescent 3 Tryptophanes (accepteurs) (fluorescents) à Å du Tb3+ 43 SLIDES

28 “GATE”: KD (µM) koff (sec-1) kon (µM-1sec-1) Glutamate: 0.06 0.0002
-CH2-CH2-COO- 0.06 0.0002 0.003 Aspartate: -CH2-COO- 0.13 0.0019 0.014 Glutamine-(wt) -CH2-CH2-CONH2 2.00 0.0064 Serine: -CH2OH 0.80 0.6500 0.810 Threonine: -CHOH-CH3 2.30 0.9100 0.400 Asparagine: -CH2-CONH2 1.90 1.0200 0.540 Glycine: -H 1.40 2.0000 1.430 Alanine: -CH3 2.80 3.7900 1.350 43 SLIDES

29 Q S,T D N,G,A Q E Liaison Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+ association
dissociation E Energie Libre Q S,T N,G,A Ca2+ + EF-hand EF-hand-Ca2+ Chemin réactionnel Chemin réactionnel 43 SLIDES

30 Comment pourrait-on traduire par un modèle stoechiométrique les expressions suivantes?
Le ligand reconnaît le récepteur. L’agoniste reconnaît le récepteur, qui s’active (laisse passer les ions Na+, Ca2+, ou Cl- ) Les benzodiazépines reconnaissent un site accessoire sur le récepteur du GABA, facilitent la reconnaissance de ce dernier, et permettent l’ouverture du canal Cl- L’agoniste reconnaît le récepteur, qui recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. Pourrait-il favoriser la formation d’un complexe de basse affinité? Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. 43 SLIDES

31 Rappel: Liaison à un site:
L’association du radioligand : Peut-être suivie immédiatement par sa re-dissociation: A l’équilibre, les deux réactions se compensent exactement : 43 SLIDES

32 Cinétique de dissociation:
Beaucoup plus simple à étudier: une seule réaction doit être considérée: Sur une échelle log: Sur une échelle linéaire: -koff 43 SLIDES

33 Cinétique d’association (1):
La réaction d’association: Integration difficile puisque R, F et B varient simultanément: 43 SLIDES

34 Cinétique d’association : (2)
Il est plus facile de calculer la vitesse de diminution de R en F constant: R disparaît donc avec une constante de vitesse apparente: kobs=konF+koff 43 SLIDES

35 Cinétique d’association : (3)
Que se pase-t-il si la [Traceur] augmente? 43 SLIDES

36 Cinétique d’association : (4) linéarisation
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37 Cinétique d’association : (5) évaluation de kon, koff
La “constante de vitesse d’association” apparente, kobs, augmente proportionnellement à F koff kon 43 SLIDES

38 Que se passe-t-il si deux ligands entrent en compétition pour le récepteur?
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39 Cinétique de liaison: traceur lent et compétiteur rapide
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40 Cinétique de liaison: deux énantiomères: traceur lent et compétiteur très rapide
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41 Cinétique de liaison: traceur très rapide et compétiteur lent
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42 Cinétique de liaison: traceur racémique
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43 Il suffit que k-2 soit <<k-1…
Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. Ensuite, le récepteur est reconnu par l’arrestine et internalisé. Il suffit que k-2 soit <<k-1… 43 SLIDES