Conception, Propriétés Fonctionnelles

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1 Conception, Propriétés Fonctionnelles
Une Nouvelle Génération d’Analogues Non Naturels de l’Antigène Tumoral Humain Melan-A/MART-1 :  Conception, Propriétés Fonctionnelles  et Perspectives d’Utilisation en Immunothérapie Antitumorale Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale Pr F. Amalric Groupe d’Immunopharmacologie Structurale Dr J.-E. Gairin Avant de commencer, je voudrais remercier les membres du jury de leur presence aujourd’hui et d’avoir bien voulu evaluer mon travail de these. Les travaux que j’ai realise au cours de ma these ont consister en la conception d’une nouvelle generation d’analogues de l’antigene tumorale humain Melan-A. Je vous presenterai la strategie que nous avons suivi pour la conception de ces nouveau composes antigeniques, l’analyse de leur proprietes fonctionnelles, et les perspectives de leur d’utilisation en immunotherapie antitumorale. Ces travaux ont ete realise sous la direction de Jean-Edourard Gairin au sein du groupe d’immunopharmacologie struscturale, a L’institut de Pharmacologie et de biologie structurale dirige par le Professeur F. Amaric In the second part of my talk, I would like to present to you the results I obtain during my PhD. The project I developed concern the ….

2 Immunosurveillance du Cancer
Réponse immunitaire contre le cancer  - Immunité innée Lymphocytes NK, T gd - Immunité acquise Lymphocytes T auxiliaires, cytolytiques Girardi et al, Science (2001) Identification des antigènes de tumeurs Rosenberg et al, Nature Medecine (1998) Immunothérapie du cancer Rosenberg N. Engl. J. Med. et al, (1985) - Antigènes peptidiques (IL- 2, cellules dendritiques) - Transfert adoptif de CTL antitumoraux Cellule Tumorale Lymphocyte T Van der Bruggen et al, Science (1991) De nombreux travaux ont permis de mettre evidence qu’il existe une reponse immunitaire contre les cellules tumorales. L’ensemble de ces resultats a conduit a l’elaboration du concept d’immunosurveillance du cancer. Les cellules du systemes immunitaires, comme par exemple ici un lymphocyte T, sont capables de reconnaitre specifiquement les cellules tumorales et les lyser et de conduire au rejet de la tumeur. La reponse immunitaire contre les tumeurs met en jeu l’immunite inne dont les effecteurs cellulaires sont les lymphocytes NK et les lymphocytes T gd, et l’immunite acquise dont les effecteurs cellulaires sont les lymphocytes T auxilliaires et les lymphocytes T cytolytiques. L’improtance des lymphocytes T dans pour l’mmunosurveillance des cancers a recemment ete souligne par des travaux parus dans science, qui montre la plus grande succeptibilite de souris transgenique deficiente en cellules T au developpement de tumeurs chimio-induites. L’identification des antignes tumoraux présent à la surface des cellules tumorales et reconnus par les lymphocytes T a permis d’envisager des approches immunotherapeutiques du cancer ayant pour objectif de stimuler specifiquement le systeme immunitaires contre les cellules tumurale. Differents protocoles d’immunotherapie du cancer ont ete envisager parmi lesquels, le transfert adoptif de lymphocytes T antitumoraux ou l’utilisation d’antigenes tumoraux sous formes peptidique associe avec des cytokines comme l’IL2 par exemple ou des cellules presentatrices professionnelles d’antigen.

3 Identification des Antigènes de Tumeurs
Caractérisation : - Approche génétique - Approche biochimique Origines : - Gènes silencieux - Différenciation - Mutations - Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs - Virus associés aux tumeurs Caractéristiques : - Spécifiques des tumeurs - Partagés par différentes tumeurs  L’identification des antigènes de tumeurs a été une étape clé pour le developpement de protocoles d’immunothérapies du cancer. Initialement, les antigenes de tumeurs ont ete caracterises par une approche genetique, consistant a identifier de le gene codant pour l’antigene puis a deduire l’epitope reconnus par les lymphocytes T antitumoraux. Par la suite, une approche biochimique utilisant la spectrometrie de masse a permis de confirmer l’expression de certains antigenes a la surface des cellules tumorale et de caracteriser de nouveau antigenes issus de modifications post-traductionnelles par exemple qui ne peuvent pas etre predit par la sequence genomique. Les antigenes tumoraux sont d’origines variees. Ils peuvent estre issus de genes silencieux succeptible d’etre exprimer au niveau des tumeurs, de genes de differentiations exprimes hors contexte, de genes mutes, d’oncogenes ou de genes suppresseurs de tumeur ayant subit des mutations, et enfin ils peuvent etre derive virus associes a certains type de tumeur. Dans une perspective d’utilisation en immunotherapie, les antigenes tumoraux doivent presentes des caracteristiques particulieres. D’une part ils doivent etre exprimes specifiquement au niveau de tumeurs, mais pas dans les tissus sains, et d’autre part, ils doivent etre partages par des tumeurs d’origines histologiques differentes.

4 Présentation des Antigènes Tumoraux aux CTL
Garboczi, D. N., et al. Nature, 1996 Va Vb Chaîne Lourde b2M Cb Cellule T Cellule Cible TCR Peptide Antigénique Les antigenes tumoraux sont presentes a la surface des cellules tumorales en association avec le CMH de class I et sont reconnu par les lymphocytes T cytolytiques par l’intermediaire du recepteur T. Le peptide antigenique est ainsi au centre des relations entre le lymphocyte T et la cellule cible. Ces dernieres annees, de nombreuses etudes ont permis de mettre en evidence que la structure de l’antigene conditionne non seulement sa capacite de liaison au CMH, mais aussi sa capacite d’activation des lymphocytes T. Les données structurales qui ont été obtenues confirment ces résultats. La structure radiocristallographique du complexe peptide-CHM-TCR montre que certain residus du peptide antigenique ici en vert sont important pour la liaison au CMH alors que d’autres residus impliqués dans la reconnaissance par les CTL sont orientes ves le recepteur T. L’ensemble de ces resultats a permis de batir une veritable pharmacologie du recepteur T, ou le peptide antigenique presente des proprietes agoniste, agoniste partiels ou antagoniste. CMH

5 Utilisation des Antigènes de Tumeurs en Immunothérapie Antitumorale
- Cellules Dendritiques - ADN (Vecteur plasmidique) - Protéines ou Peptides Antigéniques - Vecteurs Bactériens ou Viraux Cellule T Cellule Présentatrice Depuis leur identification, les antigènes de tumeurs ont été utilisés en immunothérapie antitumorale sous différentes formes: ADN plasmidique, exprimés par l’intermédiaire de vecteurs bactériens ou viraux, présentés par les cellules dendritiques, sous formes de protéines ou de peptides antigéniques. L’objectif commun de ces différents protocoles est d’induire des lymphocytes T cytolytique antitumoraux par l’intermédiaires de la reconnaissance spécifique et efficace de l’antigène peptidique par les lymphocytes T.

6 Les Peptides Antigéniques comme Agents Thérapeutiques?
AVANTAGES 1 - Réponse immunitaire spécifique 2 - Effets secondaires réduits 3 - Structure modulable LIMITATIONS 1 - Faible immunogénicité 2 - Dégradation rapide 3 - Mauvaise biodisponibilité Il existe un certain nombre d’avantages a l’utilisation des peptides antigéniques comme agents thérapeutiques. Tout d’abord les peptides antigénique induisent une réponse immunitaire hautement spécifique. Ensuite, une immunisation par des peptides antigéniques ne conduits qu’a de de trés faibles effets secondaires. Enfin, la structure des peptides peut être facilement modifiée afin d’améliorer les propriétés biologiques des antigènes. Il existe de la même façon certaines limitations à l’utilisation des peptides antigéniques comme agents thérapeutiques. Les antigènes tumoraux sont le plus souvent dérivée de protéines du soi, et sont en conséquence faiblement immunogène. De par leur nature peptidique, les antigènes tumoraux sont particulièrement sensibles à la dégradation par les peptidases présentes dans les milieux bilogiques. Et enfin les antigènes peptidiques présentent une faible biodisponibilité.

7 Un Candidat pour l’Immunothérapie du Mélanome
Melan-A/MART-1: Un Candidat pour l’Immunothérapie du Mélanome - Essais cliniques de phase III avec l’antigène Melan-A sont en cours - Melan-A est exprimé dans 75% des mélanomes primaires ou métastatiques - Les peptides antigéniques Melan-A sont présentés par HLA-A*0201 - Des précurseurs de cellules T spécifiques de Melan-A existent à une fréquence élevée Parmi les antigènes tumoraux identifier jusqu’a présent, l’antigène tumorale humain MART-1/Melan-A est un candidat particuliérement intéressant pour une approche immunothérapeutique du mélanome. Cet antigène est en effet exprimé dans plus de 75% des mélanomes primaires ou métastatiques. Les peptides antigéniques dérivés de Melan-A reconnus par les lymphocytes T sont présenté par le CMH, HLA-A*0201, qui est un haplotype sur-représenté dans la population humaine. Les précursseurs lymphocytaires T réactifs vis à vis des peptides Melan-A existent à une fréquences élevée chez les patients attients de mélanome, mais aussi chez les donneurs sains. Plusieurs études ont montrées que les peptides antigéniques dérivés de Melan-A sont immunodominants dans un contexte de présentation par HLA-A*0201. Enfin des essais cliniques de phase 3 sont en cours et témoigne des espoirs que représentent l’utilisation de cet antigène en immunothérapie du mélanome.

8 Les Peptides Antigéniques Melan-A Présentés par HLA-A*0201:
Melan-A AAGIGILTV Melan-A EAAGIGILTV Melan-A26-35 A27L ELAGIGILTV Valmori et al, J. Immunol (1998) E L G I T V A Les peptides antigéniques présentés par HLA-A*0201 et reconnus par les lymphocytes T spécifiques de Melan-A qui ont été identifiés sont le nonamère Melan-A27-35, des études complementaires ont permis de montrer que le décamère Melan-A26-35 est aussi reconnu par les lymphocytes T spécifiques de Melan-A. Le peptide Melan-A26-35 A27L présentant une leucine en position 2 a été décrit par le groupe de P Romero et présente des propriétés immunologiques améliorées par rapport aux antigènes Melan-A naturels. Sliz et al, J. Immunol (2001)

9 Les Antigènes Tumoraux sont Faiblement Immunogènes
- Faible Antigénicité - Mauvaise présentation par le CMH - Faible Biodisponibilité De nombreux ttravaux ont mis en evidence la faible immunogenicite des antigenes tumoraux. Les raisons de cette faible immunogeneicite sont nombreuses. Et parmi elles, certaines sont liees aux peptide antigenique lui meme. En effet, les antigenes tumoraux presentent une faible antigenicite, consecitive a une mauvaise presentation par le CMH. De plus les antigenes peptidique presentent une faible biodisponibilite lie a une degradation dans les fluides biologique. - Dégradation dans les fluides biologiques

10 Faible Antigénicité des Antigènes Tumoraux
L’exemple de Melan-A: AAGIGILTV EAAGIGILTV 4 0,25 50 20 Affinité pour HLA-A*0201 CI50 nM Reconnaissance par les CTL CE50 nM Dégradation t1/2 min 15 50 45 La limitation de la faible antigénicité des antigènes tumoraux peut dans certains cas être surmontée par des modification au niveau de la séquence peptidique. Dans l’exemple de l’antigène Melan-A, les peptides naturels presentent une affinite de liaison pour HLA-A2, qui est relativement faible. Dans un test de competition, le decamere Melan-A presente une affinite de liaison au CMH qui est superieur au nonamere. Et presentent donc une meilleure reconnaissance par les CTL. La substitution en position 2 de la sequence peptidique de l’alanine par un residus leucine conduit a une amelioration importante des proprietes de liaison au CMH et de reconnaissance par les CTL. La reconnaissance par les CTL est ameliore de pres de 400 fois par l’introduction de cette modification en comparaison des proprietes de reconnaissance du nonamere. Par contre, les peptides Melan-A sont degrade par les peptidases avec temps de demi vie des peptides dans le serum varie de 15 a 50 minutes. Cette degradation par les peptidases pourrait donc limiter le benefice de la meilleure antigeneicite du peptide ELA. ELAGIGILTV 0,01 2

11 Dégradation des Antigènes par les peptidases
L’exemple de MAGE-1.A1: Dégradation t1/2 EADPTGHSY 30 min > 24 h ENMeADPTGHNMeSY 0,3 3000 0,2 20 Affinité pour HLA-A1 CS50 M Reconnaissance par les CTL CE50 nM De la meme facon, la limitation de la degradation des antigenes peptidiques par les peptidases peut etre surmontee par des modification de la structure de l’antigene. Des travaux precedent, realiser dans l’equipe ont permis de demontrer a faisabilite de cette approche dans le cas de l’antigene tumorale humain MAGE-1.A1. Des experiences de degradation ont permis de montrer que le peptide MAGE-1 est rapidement degrader par les peptidases presentent dans le serum avec un temps de demi vie d’environs 30 minutes. Des modifications de la structure du peptide antigenique conferent une resistance importante a l’activite des peptidases, le peptide non naturel est alors stable durant une periode superieure a 24 heures. Par contre, les proprietes antigenique du peptide modifie sont tres fortement alteree. Le peptide modifie montre une diminution d’un facteur 100 de l’affinite de liaison pour HLA-A1, et une diminution d’un facteur de la reconnaissance par les CTL. Cette tres forte alteration de l’antigenicite du peptide modifier pourrait donc limiter le benefice de la resistance au peptidase.

12 et forte immunogénicité?
Objectifs Des Travaux Peut-on concevoir des analogues de l ’antigène Melan-A combinant résistance à la dégradation par les peptidases et forte immunogénicité? Il existent donc, dans certains cas des solutions independantes pour surmonter les limitations de la faible antigenicite, et de la degradation des peptides antigeniques. Mais jusqu’a present, et comme je viens de le montrer, ces limitations n’ont pu entre surmontee simultanement. L’objectif des travaux a donc ete de savoir s’il etait possible de concevoir des analogues de l’antigne Melan-A combinant resistance a la degradation par les peptidases forte immunogenicite?

13 I – Peut-on concevoir des Analogues Non Naturels de Melan-A résistant aux peptidases?
1 – Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A 2 – Conception d’analogues structuraux de l’antigène Melan-A 3 – Résistance à la dégradation par les peptidases Afin de repondre a cette question, nous avons base notre etude sur le peptide Melan-A ELA, et nous avons tout d’abord ete amener a etudier le mecanisme precis de la degradation de l’antigene Melan-A.

14 1 - Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A:
Diminution de l‘activité antigénique des peptides dans le sérum humain AAGIGILTV EAAGIGILTV ELAGIGILTV 50 100 10-2 10-4 10-6 Specific lysis (%) Concentration (nM) 1 Lyse spécifique (%) T0 min T60 min T240 min Temps d’incubation Des experiences initiales nous nous ont permis de mettre en evidence la diminution de l’activite antigenique des peptides Melan-A dans le serum humain. En absence d’incubation dans le serum, les differents peptides antigeniques Melan-A sont capable de sensibiliser efficacement des cellules cibles a la lyse par les lymphocytes T. Par contre apres de plus ou moins longues periodes d’incubation dans le serum, les peptides antigeniques perdent rapidement leur capacite a etre reconnus efficacement par les CTL. Les peptides Melan-A perdent donc leur activite antigenique apres incubation dans le serum humain. Ces resultats montrent que les peptides Melqn-A perdent leur activité antigénique apres incubation dans serum, et suggerent la degradation des antigenes peptidiques par les peptidases presentes dans le serum. Les peptides Melan-A perdent rapidement leur activité antigénique après incubation dans le sérum humain

15 1 - Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A:
Dégradation de l’antigène Melan-A dans le sérum humain Séparation et détection des peptides par analyse en HPLC-ESI/MS 10 20 30 Temps de rétention (min) Intensité 6.106 Absorbance (215nm) 0.1 UV CIT CIR m/z 985.5 m/z Intensité relative 985.5 [M+H]+ 100 50 600 1000 1400 1.106 ELAGIGILTV Courant Ionique Reconstruit Courant Ionique Total Ayyoub et al, JBC (1999), RCMS (1998) Afin de confirmer cette hypothese et de determiner plus precisement le mecanisme de degradation de l’antigene Melan-A dans le serum, nous avons analyse les echantillons par une methode analytique utilisant l’HPLC couple a la spectrometrie de masse. Cette methode, initialement developpee dans l’equipe par Maha Ayyoub, nous a permis de separer et d’identifier les differents peptides resultants de la degradation de l’antigène Melan-A. L’analyse du chromatogamme obtenu en detection UV permet suivre la separation des differents peptides presents dans l’echantillon. Le chrommatogramme de courant ionique total permet de suivre le signal de masse de l’ensemble des especes ioniques presentent a un instant donne. De cette enregistrement, il est possible d’extraire l’information de masse d’un seul ion et de suivre son apparition au cours du temps, cette analyse generent un chromatogramme de courant ionique reconstruit. Par exemple, le peptide Melan-A de rapport masse/charge 985 apparait sous la forme d’un pic au niveau du chromatogramme de courant ionique reconstruit. Le spectre de masse extait au temps de retention correspondant confirme la presence d’un ion majoritaire de rapport masse sur charge 985.

16 1 - Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A:
Détection et quantification des produits de dégradation non résolus en HPLC par analyse des spectres ESI/MS RT : 21.94 TIC Intensité 20 21 22 23 24 Temps (min) RIC LAGIGILTV m/z 856.5 RT : 21.77 ELAGIGILTV m/z 985.5 RT : 22.08 100 50 985.5 [M+H]+ 856.5 RT : 21.94 Intensité Relative Quantification ELAGIGILTV 100 985.5 [M+H]+ 50 RT : 22.08 Intensité Relative RIC Intensité Cette methode c’est revelee etre une methode de choix pour l’etude de la degradation de l’antigene Melan-A. Elle nous a, en effet, permis la detection et la quantification de certains produits de degradation non resolus en HPLC par analyse des spectres de masse. C’est le cas pour le peptide Melan-A et son premier produit de degradation aminoterminale. Ces peptides sont en effet eluer en HPLC a des temps de retention tres proche, et apparaissent sous la forme d’un seul pic au niveau des chromatogrammes UV et de courant ionique total. Le spectre de masse extrait au temps de retention correspondant a l’appariton de ce pic montre que les deux especes ioniques sont presentes. Par contre, l’analyse des chromatogrammes de courant ionique reconstruit pour les rapport/masse sur charges correspondants a ces deux peptides permet d’obtenir deux pics clairement separes, ayant des temps de retention differents. La separation du signal de masse des deux produits est confirmer par l’extraction des spectres de masse pour chacun de ces temps de retention ou une seule des deux especes ioniques est présente. L’intensite du signal de masse en courant ionique reconstruit nous a permis d’evaluer la quantite de chacun des produits present dans l’echatillon. LAGIGILTV Intensité Relative 856.5 [M+H]+ m/z 100 50 1200 1000 800 600 RT : 21.77 Intensité

17 Principaux produits de dégradation
1 - Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A: Cinétique Modèle de dégradation ELAGIGILTV Intensité CIR ( x105) 10 20 30 40 LAGIGILTV AGIGILTV ELAGIGIL Principaux produits de dégradation amino-terminale carboxy-terminale 60 120 240 180 Temps (min) Quantité de peptide % 25 50 75 100 E LAGIGIL TV A GIGIL TV L AGIGIL AGIGIL GIGILTV E LAGIGIL L AGIGIL TV Les etudes de degradation dans le serum humain et l’analyse par HPLC couplée à la spectrométrie de masse nous ont permis de mettre en evidence que le peptide Melan-A est rapidement degrade apres incubation dans le serum avec un temps de demi vie d’environ 40 minutes. Les analyse par HPLC couple a la spectrometrie de masse nous ont permis d’identifier et de quantifier les produits de degradation de l’antigène Melan-A. Nous avons pu mettre en evidence la presence de peptides resultant d’une degradation aminotermale et carboxy-terminale. Ces donnes nous on permis de definir le modele de degradation de l’antigene Melan-A dans le serum humain. Le peptide Melan-A est donc degrade par des amino peptidases et des dipeptidyl-carboxypeptidases. Le peptide Melan-A est dégradé dans le sérum humain par des amino-peptidases et des dipeptidyl-carboxypeptidases

18 I – Peut-on concevoir des Analogues Non Naturels de Melan-A résistant aux peptidases?
1 – Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A 2 – Conception d’analogues structuraux de l’antigène Melan-A 3 – Résistance à la dégradation par les peptidases Sur la base des informations obtenus grace a l’etude de la degradation de l’antigene Melan-A, nous avons chercher a concevoir des analogues structuraux de l’antigene Melan-A susceptible d’être résistants aux peptidases.

19 E L A G I G I L T V E - L A G I G I L - T V  
2 - Conception d’Analogues Non Naturels de Melan-A: Stratégie Mécanisme de dégradation de Melan-A  E L A G I G I L T V Modification minimale de la structure du peptide  E - L A G I G I L - T V N-hydroxylation bE, pE, dE, dL, NMeL, NMeE, aMeL, Liaison peptidique Réduite, Rétro-inversée aMeL, NMeT, dT, Amidation, Réduite b E L A G I G I aMeL T V H2N b C CH CH2 a O … OH NH CH3 H3C L’etude du mecanisme de degradation de l’antigene Melan-A dans le serum nous permis d’identifier au niveau de la sequence de l’antigene les liaisons peptidiques sensibles a l’action des peptidases, et d’introduire au niveau de ces liaisons des modifications structurales du peptide afin de le rendre resistant a l’action des peptidases. Nous avons chercher a introduire des modifications minimale de la structure peptidique, afin de limiter l’influence de ces chagement sur l’activité biologique de l’antigene. Comme par exemple l’introduction d’un groupement CH2 au niveau du squelette peptidique dans le cas des acide aminés béta ou d’un groupement methyl au niveau du carbonne alpha dans le cas des acide aminées alpha-méthylés.

20 2 - Conception d’Analogues Non Naturels de Melan-A:
H2N a C O … CH R1 R2 NH OH Liaison Peptidique - Méthylation du carbone a Me-peptide CH3 A, C N Méthylation de l’azote engagé dans la liaison peptidique NMe-peptide H HO Hydroxylation de l’amine terminale NOH-peptide A NH2 Amidation de la fonction carboxylique terminale Amide-peptide Acétylation de l’amine terminale Acetyl-peptide A : protection amino-terminale, C : protection carboxy-terminale Description Désignation Stucture Protection Nous avons utilise differents type de modification structurale de la liaison peptidique, succeptible selon leur position de proteger le peptide contre la degradation aminoterminale ou carboxy terminale. Nous avons introduit des methylations au niveau de la liaison peptidique, des modifications des extremites du peptide.

21 Acides aminés de série D
2 - Conception d’Analogues Non Naturels de Melan-A: NH C CH CH2 O … a Acide aminé cyclique Acide pyro-glutamique pE A H2N R1 H Acides aminés de série D d-a.a. A, C A : protection amino-terminale, C : protection carboxy-terminale b COOH acide bglutamique E Acides aminés b b alanine Description Désignation Stucture Protection R2 OH - Liaison peptidique Dans certains cas, nous avons utilisés des acides aminés modifiées, comme des acides aminés béta, des acides aminés cycliques, ou des acides aminés de série D.

22 2 - Conception d’Analogues Non Naturels de Melan-A:
A : protection amino-terminale, C : protection carboxy-terminale H2N a C O … CH R1 R2 NH OH Liaison peptidique - [Y1-2(CH2-NH)]-a.a. Liaison réduite CH2 A [Y1-2(NH-CO)]-a.a. Liaison Rétro-Inversée A, C Description Désignation Stucture Protection Et enfin dans d’autres cas, nous avons introduits des modifications de la liaison peptidique elle meme, comme des liaison reduite ou retro inversee.

23  2 - Conception d’Analogues Non Naturels de Melan-A:
Peptide Séquence [Ac]-Melan-A [Ac]-ELAGIGILTV [NMeE1]-Melan-A [NMeE]-LAGIGILTV [pE1]-Melan-A [Pyro]-ELAGIGILTV [ b A1]-Melan-A A]-LAGIGILTV E1]-Melan-A E]-LAGIGILTV D1]-Melan-A D]-LAGIGILTV [NOH-G1]-Melan-A [NOH]-GLAGIGILTV [dE1]-Melan-A [dE]-LAGIGILTV [dL2]-Melan-A E-[dL]-AGIGILTV a MeL2]-Melan-A E-[ MeL]-AGIGILTV [NMeL2]-Melan-A E-[NMeL]-AGIGILTV y 1-2 (CH 2 -NH)]-Melan-A -NH)]-LAGIGILTV (NH-CO)]-Melan-A (NH-CO)]-LAGIGILTV MeL8]-Melan-A ELAGIGI-[ MeL]-TV [dL8]-Melan-A ELAGIGI-[dL]-TV [NMeT9]-Melan-A ELAGIGIL-[NMeT]-V [dT9]- Melan-A ELAGIGIL-[dT]-V [V10-CONH ]-Melan-A ELAGIGILTV-[CONH ] 8-9 ELAGIGIL-[ -NH)]-TV [NMeE1, V10-CONH [NMeE]-LAGIGITV-[CONH [NMeE1, [NMeE]-LAGIGI-[ [pE1, V10-CONH [Pyro]-ELAGIGILTV-[CONH [pE1, [Pyro]-ELAGIGI-[ A1, V10-CONH A]-LAGIGILTV-[CONH A1, A]-LAGIGI-[ E1, V10-CONH E]-LAGIGILTV-[CONH E1, E]-LAGIGI-[ D1, V10-CONH D]-LAGIGILTV-[CONH D1, D]-LAGIGI-[ [NOHG1, V10-CONH [NOH]-GLAGIGILTV-[CONH [NOHG1, [NOH]-GLAGIGI-[ MeL2, Me]-LAGIGI-[ MeL2, V10-CONH Me]-LAGIGILTV-[CONH MeL2, NMeT9]-Melan-A Me]-LAGIGIL-[NMeT]-V MeL2, dT9]-Melan-A Me]-LAGIGIL-[dT]-V ALAGIGIL-[ Modifications Carboxy-terminales  Modifications Amino-terminales Modifications Amino et Carboxy-terminales Nous avons ainsi synthetiser un ensemble d’analogues non naturels présentants des modifications amino-terminales, ou de modifications carboxy- terminales, ou bien presentant des modification amino et carboxy-terminale.

24 I – Peut-on concevoir des Analogues Non Naturels de Melan-A résistant aux peptidases?
1 – Etude de la dégradation de l’antigène Melan-A 2 – Conception d’analogues structuraux de l’antigène Melan-A 3 – Résistance à la dégradation par les peptidases La question suivante était de savoir si les modifications structurale de l’antigène Melan-A etaient efficaces pour protéger le peptide de la degradation par les peptidases?

25 Modification Amino-terminale Modification Carboxy-terminale
3 - Résistance à la dégradation par les peptidases: [bD1]-Melan-A Modification Amino-terminale t1/2 < 1 h LAGIGILTV bDLAGIGIL bDLAGIGILTV Peptide Restant (%) 120 240 Temps (min) 180 60 100 50 [y8-9(CH2-NH)]-Melan-A Modification Carboxy-terminale t1/2 ~ 3.5 h ELAGIGIL-[y(CH2-NH)]-TV ELAGIGIL-[y(CH2-NH)] LAGIGIL-[y(CH2-NH)]-TV 120 240 180 60 Temps (min) 100 50 Peptide Restant (%) [bD1, aMeL8]-Melan-A Double Substitution t1/2 > 24 h bDLAGIGI-[aMeL]-TV bDLAGIGIL LAGIGI-[aMeL]-TV 120 240 24h Temps (min/h) 100 50 Peptide Restant (%) Afin de répondre a cette question, nous avons realiser des experiences de deradation dans le serum humain suivi d’une analyse par HPLC couplée à la spectrométrie de masse. Dans le cas des analogues presentant des modifications aminoterminales, aucun produits de degradation aminoterminale n’est detectéee ces analogues sont efficacement protégés de la degradation par les aminopeptidases. Par contre, l’apparition d’un peptide resultant d’une degradation carboyterminale montre que ces analogues sont dégradés par les dipeptidyl-carboxypeptidases. De la meme façon, les analogues ayant des modifications carboxyterminales sont efficacement proteges des la degradation par les carboxypeptidases, mais sont degrades par les aminopeptidases. Dans ces deux cas le temps de demi-vie des peptides dans le serum n’est que peu augmenté en comparaison du temps de demi vie du peptide non modifier. Finalement, seuls les peptides presentant des doubles substitutions amino et carboxy terminales se sont reveler totalement resistant à la degradation, et ont un temps de demi vie dans le sérum supérieur à 24 heures. En conclusion, les modification simples protègent localement les peptides de la dégradation, et des doubles substitutions sont necessaire pour une protection totale. 1 – Les modifications simples protègent localement de la dégradation 2 – Des doubles substitutions sont nécessaires pour une protection totale

26 I – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont résistants aux peptidases
Amidation de la fonction carboxylique terminale  Autres modifications de la fonction carboxylique terminale  Ces expériences de degradation dans le serum nous ont permis de mettre en évidence que l’ensemble des analogues non-naturels doublement substitutés étaient résistant a la degradation par les peptidases avec des temps de demi vie dans le serum tres superieur a celui du peptide non modifié. Nous avons pu mettre en evidence des différences au niveau de l’efficacité de protection de certaine modification. En effet, les peptide présentant amidation de la fonction carboxyliques se sont révéler moins résistants avec un temps de demi vie d’environ 12h que les analogues incluants d’autres type de modification de l’extrémites caboxy-terminale qui sont beaucoup plus stable, et qui présentent un temps de demi-vie dans le serum supérieur à 24 heures.

27 II – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont-ils antigéniques?
1 – Affinité pour HLA-A*0201 2 – Reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A La question suivante est de savoir quel peut etre l’impact des modifications de la structure du peptide sur ses propriétés biologiques. Nous avons donc chercher a déterminer si les analogues non naturels de Mela-A étaient antigénique. Pour répondre a cette question, la premiere étape a donc consisteé a déterminer l’affinité des analogues non naturels pour HLA-A*0201.

28 1 - Affinité pour HLA-A*0201:
Essai de liaison à HLA-A*0201 par compétition Lyse Spécifique (%) 30 60 100 10 1000 1 Concentration (nM) EAAGIGILTV AAGIGILTV ELAGIGILTV [bA1, aMeL8] [NMeE1, Amide] [bA1, Amide] FAIBLE (9 / 18*) MOYENNE (6 / 18*) FORTE (3 / 18*) * : Nombre total d’analogues doublement substitués Nous avons déterminer l’affinité des analogues non naturels de Melan-A doublement modifiés grace a un essai de liaison par compétition. Le peptide ELA présente une activité compétitrice plus importante que le nonamère et le décamère Melan-A, ce qui témoigne d’une meilleure affinité de liaison a HLA-A*0201. Dans certain cas, les modifications structurales du peptide ElA ont conduit a une perte d’affinité de liaison du peptide pour HLA-A2. C’est le cas pour 9 analogues doublement substitués sur 18. Dans d’autre cas la diminution de l’affinité pour HLA reste limite, et 6 analogues sur 18 ont une affinité relativement bonne pour HLA-A2. Finalement, nous avons identifer 3 analogues non naturels doublement substitués ayant une affinité de liaison a HLA-A2 comparable a celle du peptide non modifié. Les analogues de Melan-A résistants aux peptidases peuvent se lier efficacement à HLA-A2. Les analogues de Melan-A résistant aux peptidases peuvent se lier efficacement à HLA-A*0201

29 II – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont-ils antigéniques?
1 – Affinité pour HLA-A*0201 2 – Reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A La deuxieme étape afin de déterminer l’antigénicité des analogues non naturels de Melan-A a consister a determiner leur capacité a être reconnus par les CTL spécifiques de Melan-A.

30 2 - Reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A:
Essai de cytoxicité, lignée CTL polyclonale mono-spécifique de Melan-A 100 50 0.0001 0.01 1 Concentration (nM) EAAGIGILTV AAGIGILTV ELAGIGILTV Lyse Spécifique (%) [NMeE1, aMeL8] [bA1, aMeL8] [bA1, Amide] FAIBLE (9 / 18*) MOYENNE (5 / 18*) FORTE (4 / 18*) * : Nombre total d’analogues doublement substitués Afin de determiner si les analogues non naturels sont reconnus efficacement par les CTL spécifique de Melan-A, nous avons réaliser de essai de cytotoxicité et utilisé une lignée de CTL polyclonale mono-specifique de l’antigène Melan-A. Le peptide ELA est reconnu plus efficacement par les CTL que les autres peptides Melan-A. Cette meilleure reconnaissance est probablement lié a sa meilleure affinité de liaison pour HLA-A2. Certaines modifications structurale du peptide ELA conduisent a une diminution importante de la reconnaissance par CTL. C’est le cas pour 9 analogues sur 18 doublement substitutés. Certains analogues sont reconnus de facon relativement efficace par les CTL. Et finalement nous avons identifier 4 analogues sur 18 qui sont reconnus avec la meme efficacité que le peptide non modifié par les CTL spécifiques de Melan-A. Les analogues résistants à la degradatin peuvent donc être reconnus efficacement par les CTL spécifiques de Melan-A. Les analogues résistant à la dégradation peuvent être reconnus efficacement par les CTL spécifiques de Melan-A

31 Activité Compétitrice Reconnaissance par les CTL
II – Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont antigéniques Liaison à HLA - A*0201 Activité Compétitrice CI 50 [nM] 20 2 < 0.01 >1000 > 1000 200 400 500 110 100 90 45 30 28 9 3 1 Reconnaissance par les CTL Activité Antigénique CE 50 [nM] 4 0.25 0.01 - 2.5 1 0.3 10 0.5 0.2 10. 5 0.04 0.03 0.35 0.02 0.18 0.15 Nous avons montrer que certains analogues non naturels de Melan-A sont antigéniques, c’est a dire qu’ils présentent une bonne liaison a HLA-A2 et qu’ils sont reconnus efficacement par les CTL. Il existe, globalement, une correlation entre la liaison a HLA-A2 et la reconnaissance par les CTL. Les analogues présentant une bonne affinité de liaison a HLA-A2 sont mieux reconnus que les analogue de faible affinité.

32 Conclusion - I - Identification des liaisons peptidiques sensibles aux peptidases - Conception d’analogues non naturels - Protégés efficacement de la dégradation par les peptidases - Bonne affinité pour HLA-A*0201 - Bonne reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A  Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont résistants aux peptidases Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont antigéniques What are the perspective to this work? One important question is to know if the increased in vitro immunogenicity of the non natural Melan-A analogues can be extrapolated to the induction of immune response. In vivo Studies in A2 Kb Tg mouse model are currently in development for the evaluation of several critical parameters for the efficient induction of a specific anti tumoral immune response. Indeed, we think that such compounds can be an attractive way to efficiently control the dose of peptide injected, and thus the avidity of the CTL induced. But we will have to check possible induction of peripheral tolerance due to peptide persistance in the body after jnjection. En conclusion de cette première partie, l’etude de la dégradation de l’antigène Melan-A nous a permis d’identifer les liaisons sensibles aux peptidases, de concevoir des analogues non naturels de l’antigènes, dont nous avons pu montrer qu’ils sont protégés efficacement de la degradation par les peptidases. Certains analogues non naturels de Melan-A sont antigéniques et présentent une bonne affinité pour HLA-A2 et une bonne reconnaissance par les CTL spécifiques de Melan-A.

33 III - Les Analogues Non Naturels sont-ils Immunogènes ?
1 – Induction de CTL spécifiques de Melan-A 2 – Reconnaissance des peptides Melan-A 3 – Reconnaissance des cellules tumorales La question suivante a été de savoir si les analogues non naturels antigéniques sont immunogènes. Afin de répondre à cette question, nous avons donc chercher a déterminer leur capacité à induire des CTL spécifiques de Melan-A.

34  1 - Induction de CTL spécifiques de Melan-A:
Mise en évidence de CTL spécifiques de Melan-A Phycoérytrine Streptavidine Phycoérytrine Streptavidine Monomère b2M/peptide/HLA Phycoérytrine Streptavidine Monomère b2M/peptide/HLA Marquage des CTL spécfiques de l’antigène Analyse directe par cytométrie de flux Tri cellulaire Utilisation des tétramères de CMH-I  Afin de mettre en evidence les CTL spécifiques de Melan-A, nous avons utiliser des tétramères de CMH-I. Ces molécules sont constituées de complexes peptide-HLA-b2M tétramérisés par l’intermédiaire de la streptavidine, elle même associée à la phycoerytrine. Les tétramères permettent le marquage des CTL spécifiques de l’antigène et une détection directe par cytométrie de flux. L’utilisation des tétramères et de la cytométrie de flux permet da quanfier au sein d’un population cellulaire la proportion de lymphocytes spécifiques de l’antigène, qu’il est possible d’isolé par tri cellulaire. Monomère b2M/peptide/HLA d ’après McMichael et O ’Callaghan 1998

35 A2/Melan-A TétramèrePE
1 - Induction de CTL spécifiques de Melan-A: 1 - Stimulation de lymphocytes du sang périphérique de donneurs sains HLA-A*0201 2 – Analyse par cytométrie de flux des cellules T spécifiques de Melan-A (CD8+ tétramères A2/Melan-A +) ELAGIGILTV Sans peptide [bE1, aMeL8]-Melan-A 3.1% 5.3% 0.1% 2.8% 4.5% CD8FITC 0.3% 0.7% HD224 HD410 HD220 A2/Melan-A TétramèrePE Sans peptide 0.1 Melan-A26-35 A27L 3.1 2.8 0.3 2.7 2.2 [ b A1, a MeL8]-Melan-A 6.0 4.3 0.2 5.3 4.5 0.7 5.6 0.6 [NOHG1, amide]-Melan-A 2.0 1.0 0.5 Peptide utilisé pour la stimulation HD224 HD410 HD220 Immunogénicité in vitro (% A2/Melan-A tétramère + CD8 ) E1, D1, amide]-Melan-A NOHG1, p Dans le but de determiner la capacité des analogues non naturels a induire des CTL spécifiques de Melan-A, nous avons réaliser des expériences de stimulation in vitro. Les analogues de Melan-A les plus antigéniques ont ete utilisée pour stimuler des lymphocytes du sang périphérique de donneurs sains HLA-A2. La presence de lymphocytes T specifiques de Melan-A est analysée par cytometrie de flux apres un double marquage par les tétramères HLA-A2-Melan-A et un anticorps dirigée contre CD8. Ces expériences ont ete réalisée a partir des lymphocytes de trois donneurs différents. Après une stimulation en absence de peptide, aucun lymphocyte spécifique de Melan-A n’est détectée. Dans le cas des expériences de stimulations réalisées avec le peptide ELA, des lymphocytes T tétramères positifs spécifiques de Melan-A peuvent etre détectées. Le pourcentage de cellules T spécifique de l’antigène obtenu est variable pour les trois donneurs, et est en rapport avec la frequence des precursseurs lymphocytaire qui est différentes chez les trois donneurs. Chez deux donneurs, environ 3% de lymphocytes T spécifiques de Melan-A sont detectees apres stimulation par le peptide ELA. Dans le cas d’une stimulation avec les analogues non naturels, des lymphocytes T tetramères positifs sont de la même façon detecte chez les trois individus. Tous les analogues non naturels de Melan-A que nous avons tester se sont révéler capable d’induire des lymphocytes T spécifique de Melan-A, mais avec une plus moins grande efficacité. Certains analogues induise un pourcentage de lymphocytes T spécifique de Melan-A plus faible ou similaire au peptide non modifié. Nous avons identifier 3 analogues non naturels, qui induisent un pourcentage de lymphocytes T 2 fois supérieur a celui obtenu par une stimulation avec le paptide ELA. Des résultats identique ont été obtenu chez les trois donneurs. Ces expériences montrent que des CTL spécifiques de Melan-A peuvent donc etre induits apres stimulation in vitro par les analogues non naturels. Des CTL spécifiques de Melan-A sont induits après stimulation par les analogues non naturels

36 III - Les Analogues Non Naturels sont-ils Immunogènes ?
1 – Induction de CTL spécifiques de Melan-A 2 – Reconnaissance des peptides Melan-A 3 – Reconnaissance des cellules tumorales La question suivante a été de savoir si les CTL induits par les analogues non naturels de Melan-A sont susceptible de reconnaitre les peptides Melan-A non modifiés.

37 2 - Reconnaissance des peptides Melan-A:
1 - Tri des cellules CD8+ A2/Melan-A/tétramère+ 2 - Reconnaissance des peptides Melan-A Peptide utilisé pour la stimulation HD224 100 Lyse Spécifique (%) 50 1000 10 0.1 0.001 concentration (nM) ELAGIGILTV A2/Melan-ATétramèrePE EAAGIGILTV AAGIGILTV ELAGIGILTV CD8FITC 100 Lyse Spécifique (%) 50 1000 10 0.1 0.001 concentration (nM) [bA1, aMeL8] A2/Melan-ATétramèrePE Apres stimulation in vitro par les analogues non naturels, les cellules CD8 positives tetramères positives ont ete isolées par tri cellaire, et la capacite ces CTL à reconnaitre les peptides Melan-A par a ete détermine par un test de cytoxicité. Dans le cas d’une stimulation avec le peptide ELA, les CTL spécifiques de Melan-A induit reconnaisse efficacement les différents peptides Melan-A. De la même façon, les CTL spécifiques de Melan-A induit après une stimulation avec les analogues Melan-A sont capable de reconnaitre les peptides Melan-A avec la même spécificité que les CTL induits avec le peptide non modifié. Le peptide ELA est mieux reconnu que le décamère, qui est lui même mieux reconnu que le nonamère. Les CTL induits avec les analogues non naturels reconnaissent efficacement les peptides Melan-A. CD8FITC Les CTL induits avec les analogues non naturels reconnaissent efficacement les peptides Melan-A

38 III - Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont-ils Immunogènes ?
1 – Induction de CTL spécifiques de Melan-A 2 – Reconnaissance des peptides Melan-A 3 – Reconnaissance des cellules tumorales Une question importante concerne la capacite des CTL induits par les analogues non naturels de Melan-A a reconnaître les cellules tumorales, qui expriment naturellement l’antigène Melan-A.

39 Rapport Effecteur/Cible
3 - Reconnaissance des cellules tumorales: Peptide utilisé pour la stimulation ELAGIGILTV [bA1, aMeL8] [bE1, aMeL8] [bD1, aMeL8] Lyse Spécifique(%) 100 50 1 10 Rapport Effecteur/Cible Mel 290 Mel 275 Na8 Apres stimulation in vitro avec les analogues non naturels de Melan-A et tri cellulaire des population tetramères positives, la capacité des CTL a reconnaitre les cellules tumorale est recherchee par un test de cytotoxicité. Trois lignees tumorale dérive de melanome ont ete utilisé. Les cellules Mel 275 et Mel 290 qui exprime natuerellement l’antigène Melan-A, la lignée tumorale Na8 qui n’exprime pas l’antgène Melan-A est utilisée comme controle. Les CTL induits avec le peptide ELA sont capable de reconnaitre et de lyser les cellules tumorale exprimant Melan-A, mais ne lysent pas les cellules Na-8. De la même façon, les CTL induits par les analogues non naturels reconnaissent et lyse les cellules tumorales exprimant l’antigène Melan-A, mais pas les cellules Na8. Les CTL induits par les anaologues non naturels de Melan-A reconnaissent spécifiquement et lysent efficacement les cellules tumorale. Les CTL induits par la stimulation avec les Analogues Non Naturels de Melan-A Reconnaissent Spécifiquement et Lysent efficacement les Cellules Tumorales

40 Conclusion - II Les Analogues Non Naturels de Melan-A sont Immunogènes   Les analogues non naturels de Melan-A Induisent efficacement des CTL in vitro What are the perspective to this work? One important question is to know if the increased in vitro immunogenicity of the non natural Melan-A analogues can be extrapolated to the induction of immune response. In vivo Studies in A2 Kb Tg mouse model are currently in development for the evaluation of several critical parameters for the efficient induction of a specific anti tumoral immune response. Indeed, we think that such compounds can be an attractive way to efficiently control the dose of peptide injected, and thus the avidity of the CTL induced. But we will have to check possible induction of peripheral tolerance due to peptide persistance in the body after jnjection. - L’immunogénicité in vitro est améliorée Les différentes experiences que je viens de décrire montrent que les analogues non naturels de Melan-A sont immunogènes. Ils sont en effet capable d’induire efficacement des CTL spécifique de Melan-A in vitro. Nous avons pu mettre en evidence que les analogues structuraux de Melan-A possédent une immunogénicité ameliorée dans la mesure ou un pourcentage plus eleve de CTL spécifique de l’antigène est induit que lors d’une stimulation avec le peptide ELA. De plus, les CTL induits reconnaissent efficacement les peptides Melan-A et les cellules tumorales exprimant naturellement l’antigène Melan-A.  Les CTL induits in vitro par les analogues non naturels de Melan-A: - Reconnaissent efficacement les peptides Melan-A - Reconnaissent efficacement les cellules tumorales

41 Conclusions Générales
 Les Analogues Non Naturels de Melan-A: - Résistent à la dégradation par les peptidases - Stimulent la prolifération de CTL spécifiques des tumeurs What are the perspective to this work? One important question is to know if the increased in vitro immunogenicity of the non natural Melan-A analogues can be extrapolated to the induction of immune response. In vivo Studies in A2 Kb Tg mouse model are currently in development for the evaluation of several critical parameters for the efficient induction of a specific anti tumoral immune response. Indeed, we think that such compounds can be an attractive way to efficiently control the dose of peptide injected, and thus the avidity of the CTL induced. But we will have to check possible induction of peripheral tolerance due to peptide persistance in the body after jnjection. - Présentent une Immunogénicité améliorée Nouvelle génération d’analogues antigéniques combinant résistance aux peptidases et immunogénicité améliorée En conclusion générale de travail, nous avons developpe des analogues non naturels de Melan-A qui résistent a la dégradation par les peptidases, qui stimulent la prolifération de CTL spécifiques des tumeurs, et qui présentent une immunogénicité améliorée. Ces analogues structuraux de Melan-A constituent une nouvelle generation d’analogues antigéniques combinant résistances aux peptidases et immunogénicité améliorée qui pourrait avoir des applications potentielles extrèmement intéressante en immunothérapie du mélanome.

42 Perspectives   Généralisation de l’approche?
- Les analogues non naturels de Melan-A : Règle ou Exception? - Etude d’autres antigènes tumoraux (MAGE-1, MAGE-10, NY-ESO-1, Tyrosinase…)  L’immunogénicité in vivo? - Etudes chez la souris transgénique HLA-A2/Kb Quelles sont les perspectives des ces travaux? Tout d’abord, une question intéressante sera de savoir si cette approche est generalisable a d’autres antigène tumoraux. Les résultats obtenus avec les analogues non naturels de Melan-A pourraient être une exception lié par exemple a la fréquence particulièrement élevés des précurseurs lymphocytaires réactifs vis à vis de cet antigène. Une etude similaire menée sur d’autre modèle d’antigène tumoraux comme les antigènes MAGE-1 ou MAGE-10 dont la fréquence des précurseurs est beaucoup plus faible pourrait permettre de répondre a cette question. Nous avons montrer que les analogues non naturels de Melan-A présentaient une immunogénicité in vitro améliorée. Quant est il de l’immunogénité in vivo de ces analogues. Cette question essentielle pour envisager leur utilisation future en immunothérapie du Mélanome pourrait être abordée par des etudes chez la souris transgénique A2/Kb, afin de déterminer si la possible persistance des analogues, non naturels in vivo du a leur resistances aux peptidases, pourrait induire une meilleure réponse immunitaire ou bien a l’inverse une tolerance périphérique à l’antigène. - Utilisation en immunothérapie du Mélanome? - Réponse Immunitaire ou Tolérance?

43 Remerciements… Immunopharmacologie Structurale
LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH Immunopharmacologie Structurale Spectrométrie de Masse et Structure de Biomolécules Onco-immunologie Clinique Jean-Edouard Gairin Bernard Monsarrat Pedro Romero Isabelle Dufau Odile Schiltz Danila Valmori Christophe Nguyen Stéphane Claverol Maha Ayyoub Avant de terminer, je voudrais remercier les différentes personnes qui ont participé a ces travaux. Tout d’abord au sein de groupe d’immunopharmacologie structurale, je voudrais remercier Jean-Edouard Gairin pour m’avoir fait confiance dans la réalisation de ces travaux. Je voudrais remercier Isabelle Dufau et Christophe Nguyen qui ont réaliser la synthèse de analogues de Melan-A. Je tiens a remercier Sophie Millot et Delphine Labourdette qui ont travailler ce projet durant leur stage de DEA, et tous les membres de l’équipe, Joelle Riond, Elishabeth Neuhauser, Bo Xu, Sylviane Julien, sans oublier Honoré Mazarguil et ses précieux conseil pour la synthèse. Je remercie aussi les membre de l’équipe de Spectrométrie de Masse et Structure de Biomolécules, Bernard Monsarrat, Odile Schiltz, Stéphane Claverol, Paul Alvinerie pour leur aide et leur conseils lors des analyses de spectrométrie de masse. Je tiens a remercier aussi Pedro Romero, Danilla Valmori et Maha Ayyoub du groupe d’Oncoimmunologie Clinique de L’institut Ludwig de Recherche sur le Cancer, et enfin je vous remercie de votre attention. Sophie Millot, Delphine Labourdette Paul Alvinerie Joelle Riond, Elisabeth Neuhauser, Bo Xu, Sylviane Julien, Honoré Mazarguil