Laboratoire de virologie moléculaire Camille SUREAU

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1 Étude du déterminisme de maturation et d’infectiosité des virus des hépatites B et D
Laboratoire de virologie moléculaire Camille SUREAU Institut National de la Transfusion Sanguine PARIS

2 Le virus de l’hépatite B (HBV)

3 Généralités (i) Plus de 350 millions de patients sont chroniquement infectés par HBV (OMS). Il existe un vaccin efficace et sûr depuis 1984. 95% Guérison 70% Dans 5% des cas, l’infection deient chronique 30% de porteurs sont des porteurs sains, et 70% des poteur developpent une hépatite chronique qui peut évoluer vers… Hépatite Aiguë Infection Hépatite chronique Cirrhose Hépatocarcinome Chronicité 5% Porteurs sains 30%

4 Généralités (ii) Hepadnaviridae Orthohepadnavirus HBV WMHBV GSHV WHV
Avihepadnavirus DHBV HHBV Membre prototype ou prototype tout court?

5 Les particules HBV Diamètre: 42 à 46 nm Diamètre: 20 nm
Longueur variable L’HBV est caractérisé par un mode de bourgeonnement unique parmis les virus animaux, assuré intergralement par les protéines d’enveloppes. La conséquence est la sécrétion majoritaire de particules Vides appeleé particules sous virales… Diamètre: 20 nm 100 nm

6 Le virion mature: la particule de Dane
La structure la plus externe est constituée d’une enveloppe lipoprotéique dans laquelle sont ancrées les 3 protéines d’enveloppe HBV…. Cette structure externe renferme la nucléocapside, formée par multimérsation d’un seul type de protéine, la protéine de capside, codée par le génome HBV. Le genome, present dans la capside, est un génome ADN partiellement Bicaténaire, auquel est lié une protéine:la polymérase virale

7 Le génome HBV ADN circulaire partiellement bicaténaire
Organisation génétique très compacte: tous les nucléotides sont codants les ¾ sont inclus dans deux ORF quatre ORF sont présentes Sept protéines virales : polymérase virale protéine X (non structurale) protéine de capside protéine « e » (AgHBe) trois protéines d’enveloppe

8 Le Cycle de réplication HBV
L’interaction des virions mature avec la cellules cible est assuré par les protéines d’enveloppe. Suite à cette interaction, le virions est internalisé par endocytose, puis la capside est adressée sous forme intacte au panier nucléaire, l’ADN patiellement bicaténaire est relargué et réparé en ADNccc qui sert ensuite de matrice a la transcription de plusieurs ARNm. . Certains, par traduction, permettent la synthèse des protéines d’enveloppe dans la membrane du RE. D’autre ARN permettent la synthèse de nouvelles nucléocapsides. Un ARN, appelé prégénomique, permet par transcription inverse, la synthèse de l’ADN génomique partiellement bicaténaire. Comme je l’ai dit précedemment, les protéines d’enveloppe bourgeonnent spontanéement dans la lumière du RE, principalement sous forme de PSV. Dans de rares cas…

9 Les protéines d’enveloppe HBV
Les protéines d’enveloppe, réprésentée ici à la surface du virions, sont au nombre de 3 et sont codées par un cadre ouvert de lecture unique sur le génome HBV, à partir de 3 AUG différents. Elles possèdent une extrémité C terminale communes et différent entre elles par la taille de leur extrémité amino terminale. La protéines S est constituée du seul domaies S, la protéines M est…

10 La topologie des protéines d’enveloppe HBV
S-AgHBs M-AgHBs Je vais vous présenter maintenant la topologie des protéines d’enveloppe. La protéine S contient 4 DTM. L’existence des 2 premier a été démontré expériementalment, alors que celle des 2 suivantes est simplement prédite par des algoritmes informatiques. Les DTM 1 et 2 délimitent une B cytosolique Appelée BCY-I Les DTM 2 et 3 délmitent un boucle orientée dans la lumière du RE sit à la surface de virions sécrétés, cette boucle est Appelée BAG car elle porte les déterminants antigénique majeur d’HBV. Cette boucle possède un site de glycosylation utilisé dans seulement 50% des cas (encombrement stérique) Le domaine S de le protéine M adopte une topologie identique au domaine S de la protéine S. L’extention pre-S2 est transloquée cotraductionnellement dans la lumière du RE. Il existe un site de N-glycosylation en position 4 et de O-glycosylation en position 37

11 La protéine L-AgHBs pre-S1 cytosolique pre-S1 luminale RE
Lors de la synthèse de la protéines L, l’intégralité des domaines pre-S (pre-S1+pre-S2) sont localisés à la face cytoplasmique de la membrane du RE. Le domaine pre-S est alors myristilé sur la position 2 Ce n’est que plus tardivement, au niveau du CI localisé entre le RE et le golgi, que 50% des domaine pre-S sont transloqués dans la lumière du CI (et sont donc presente à la surface des virions. Cette translocation tardive empeche l’utilisation du site de glycosylation en position 4 sur preS1. CI

12 Les fonctions des protéines d’enveloppe (i)
S- et L-AgHBs sont nécessaires à la maturation HBV M-AgHBs n’a pas de rôle connu In vitro S-AgHBs fournit le moteur du bourgeonnement

13 Les fonctions des protéines d’enveloppe (ii)
L-AgHBs, par sa topologie pre-S cytosolique, permet le recrutement de la nucléocapside HBV [Domaine matrice (92-à-113)].

14 Les fonctions des protéines d’enveloppe (iii)
L-AgHBs, par sa topologie pre-S externe permet l’attachement au récepteur de la cellule cible (entrée virale).

15 Les fonctions des protéines d’enveloppe (iv)
Les protéines d’enveloppe HBV bourgeonnent spontanément dans la lumière du RE, principalement sous forme de PSV. La nucléocapside HBV peut être recrutée pour former des virions matures. Une autre structure virale peut être enveloppée. Il s’agit d’une structure ribonucléoprotéique appartenant au virus de l’hépatite delta.

16 Le virus de l’hépatite delta (HDV)

17 Généralités HDV est: Un virus enveloppé à ARN (-)
Un virus défectif, satellite occasionnel d’HBV, qui requiert la présence des protéines d’enveloppe d’HBV pour accomplir son cycle infectieux Le seul membre du genre Deltavirus

18 Le virion HDV La structure externe d’HDV est empruntée à l’HBV, elle est constituée d’une enveloppe liproprotéique supposée identique à celle de l’HBV Cette structure renferme une ribonucléoprotéine formée par association du génome HDV avec les 2 formes de la protéine qu’il encode

19 L’ARN HDV L’ARN HDV existe sous deux formes. Les deux adoptent une structure pseudo bicaténaire dite « en batonnet », liée a un autoappariement des bases sur 70% de la séquence. La polarité Négative, également appelée ARN génomique (c’est la forme retrouvé a l’interieur des virions).L’ARN antigénomique est un intermédiaire de réplication. Chacun de ces ARN possède un site de clivage. Impliqué dans la réplication. (parler plus loin des ribosymes Un cardre ouvrt de lecture unique est présent sur l’Arn antigénomque. Celui-ci code pour les protéines delta, a partir d’un AUG unique et de 2 codons stop . Dans un prmeir tps, la traduction s’effectue entre l’AUG et le premier codon stop, aboutissant a la synthèse de la prtite protéine delta A un stade plus tardif le codon stop de la petite protéine est édité en W et permet la synthèse d’une protéine plus grande de 19 residus, la grande protéine delta

20 Les protéines delta (AgHD)
Comme indiquée précédemment lles 2 protéines delta diferent entre elles par la présence sur la grande protéine d’une extention Ct de 19 résidus Ces protéines possèdent des domaines fonctionnels communs: Un signal de localisation nucléaire permet l’acheminement de la RNP vers le noyau après internaliation des virions Les signaux de polymérisation et de liaison à l’ARN permette la néosynthèse de RNP Un signal d’export nucléaire présent dans l’extention propre à la grande protéine permet la sortie de la RNP du noyau Ces protéine bien que très semblable en séquence primaire, possèdent des fonctions différentes…. S-AgHD stimule la réplication de l’ARN HDV L-AgHD inhibe la réplication et dirige la maturation

21 La réplication du génome HDV
Pol-II Je vais maintenant aborder le mode de répliction de l’ARN HDV. Dans un premier temps, l’ARN génomique sert de matrice à la synthèse d’une ARN messager qui code pour la petite protéine delta, necessaire pour stimuler la réplication L’ARN génomique sert ensuite de matrice à la synthèse d’ARN génomique selon un mécanisme dit de « cercle roulant ». Une polymérase cellulaire synthétise de l’ARN antigénomque en tournant autour de l’ARN génomique, ce qui pourrait aboutir a la synthèse de multimères. En realité, un sequence ribozye permet le clivage en monomères qui sont ensuite religué pour former des strucutres en batonnet. Le meme principe est utilisé pour synthétiser de l’ARN génomique a partir de l’ARN antigénomique.

22 Cycle de réplication HDV
Le cycle de réplicaion HDV est intimement lié a celui d’HBV. L’enveloppe HDV etant supposé identique à celle d’HBV, il est raisonnable de penser que ces 2 virus interagissent avec le meme recepteur a la surface de la cellule. Après internalisation du virus, la RNP est acheminée vers le noyau,l’ARN HDV est répliqué selon un mecanisme détaillé plus loin, l’ARN génomque s’associe avec les protéines Delta pour former la RNP HDV, est c’est ace stade que les protéine d’enveloppe HBV sont requise pour former des virions HDV mature que seront ensuite sécrété hors de la cellule et pourront… HDV Modèle d’études de l’entrée virale

23 Maturation HDV S-AgHBs est suffisante pour la maturation HDV :
elle assure le bourgeonnement elle possède un domaine matrice HDV L-AgHBs est indispensable à l’entrée virale HDV car elle porte le domaine d’attachement au récepteur. S-AgHBs…

24 Travail de thèse

25 Objectifs de la recherche
Recherche dans les BCY-I et –II de: déterminants de maturation HBV et HDV ? déterminants d’infectiosité ? Recherche dans le domaine pre-S de L-AgHBs de: déterminants d’infectiosité HDV ? (Comparaison avec les déterminants HBV) Pkoi a-t-on étudier la présence de determinant de maturation dans BCY-I et II … parcequ’elle sont disposée a la face cytosolique ou se présente les RNP et nucléocapsides candidates au bourgeonnement. Par ailleur, les tryptophane de la BCY-II sont conservé parmi l’ensemble des Orthohep, ce qui suggère un implication de ces résidu à l’étape de maturation on d’infection

26 État des connaissances sur la maturation
Domaine matrice : résidus 92 à 113 sur pre-S. Bruss, V. (1997). J Virol 71, Déterminant de maturation HBV: résidus 35 à 59 et R79 de la BCY-I. Loffler-Mary, H.,et coll.(2000). Virology 270, W-196,-199,-201 BCY-II. Jenna, S., et Sureau, C. (1999). J virol 73, Komla-Soukha, I., et Sureau, C. (2006). J virol 80, La moitié C-terminale de BCY-I n’a pas été étudiée pour la maturation des virions car les grandes délétions sont délétères pour la stabilité des protéines. HBV HDV En parler à l’imparfait Je vais commencer par vous dresser un bref bilan des connaissances antérieures à nos trauvaux Consernant, la maturation HBV, un domaine matrice à été localisé entre les résidus Un étude a égalemnt propose une participation de la moitié Nt de la BCY-I de la petit protéine d’enveloppe HBV, mais les résultats de nos travaux sont en contradiction avec cette étude. Consernant le delta, un domaine matrice à été localisé dans la BCY-II, et est formé au moins en partie par les W 196,-199,-201. Une étude en cours au labo suggère la participation de la Y 200 au domaine matrice Enfin, la moitié Ct de la BCY-I, n’a pas été étudié pour la maturation des virions HBV car elle est très sensible au mutation. IMPARFAIT

27 État des connaissances sur l’entrée virale
TLM Déterminant d’infectiosité : résidus 1 à 77 de pre-S1. Le Seyec, J. et coll. (1999). J virol 73, Myristate Bruss, V. et coll (1996). Virology 218, Domaine d’attachement au récepteur : résidus 2 et 48 de pre-S1. Gripon, P. et coll. (2005). J virol 79, Séquence TLM (résidus 149 à 160): impliquée à l’entrée virale. (Stoeckl, L. et coll., (2006). PNAS 103, EN PARLER A L’IMPARFAIT Consernant l’infectiosité, Un déterminant d’infectiosité à été localisé dans le modèle HBV au 77 premier résidu Nt de pre-S1 de L Le domaine spécifique d’attachement au récepteur a été localisé au 48 premiers résidus preS1 Il a été montré que la myristylation de L est indispensable pour l’infectiosité Enfin, il a été proposé qu’une séquence, localisée entre les résidus 146 et 160 sur pre-S, appelé TLM (motif de translocation), soit impliqué à l’étape d’entrée virale Une étude réalisé au laboratoire sur le modèle delta a mis en évidence l’importance de la boucle antigénique (principalement par les cystéines présentes) dans l’entrée virale. IMPARFAIT Boucle Antigénique : impliquée à l’étape d’entrée virale. Jaoudé, G. A., et Sureau, C. (2006). J virol 79,

28 1ere Partie Déterminants de maturation et d’infectiosité HBV et HDV dans les BCY-I et –II

29 Création et criblage de mutations permissives pour la secrétion de PSV dans la BCY-I (démarche expérimentale) Pour l’étude de la maturation HBV et HDV, les mutations doivent être permissives pour la sécrétion de PSV. Lire le titre , et parler du but en montrant le schema. Enfin décrire le protocole Transfection de cellules Huh-7 avec: pT7HB2.7 ou dérivé Analyse à J4 des protéines d’enveloppe présentes dans les cellules et les surnageants par WB (anti-S + anti-pre-S2)

30 Mutants BCY-I Voici d’ensemble des mutation que nous avons réalisée
Présentes sur les 3 protéines d’enveloppe Nous avons dans un premier tps réalisé une serie de délétion de 5 résidus remplacé par un dipeptide KL Certaines mutations ne nous ont pas donné satisfaction , car deletère pour la synthèse des protéines d’enveloppe ou la sécrétion de PSV comme nous allons le voir sur la diapo suivante Nous avons dans ce cas procédé à d’autre mutation comme des substitutions de 5 résidus par des résidus alanines ou des délétions simples Pour les régions les plus sensibles comme et l’extrémité Ct, nous avons réalisé des mutations ponctuelle en alanine en évitant les cys qui sont indispensable pour la secrétion des psv Nous avons également réalisé une mutation ponctuelle de l’arginine 79 en lysine, car cette mutation avait précédemment été décrite comme délétère pour la maturation HBV

31 Quelles sont les mutations BCY-I permissives pour la secrétion de PSV?
Voici les résultats… Le panneau du haut montre les protéines d’enveloppe dans les cellules, celui du bas dans le surnageant Decrire les forme glycosylé ou non des protéines d’enve Dans la cas du témoin +, les protéines sont correctement synthétisée et sécrété sous forme de PSV. Dans le témoin -, les protéines ne sont pas exprimées Les mutations peuvent etre divisé en 2 groupe, le premier (mutants encadré) représente les mutations permissivent pour la sécrétion de PSV (ceux ki nous interessent) Le deuxième regroupe les mutation délétères pour la synthèse ou la sécrétion des PSV L’anticorps anti-S étant dirigé contre un épitope localisé entre les positions 54 – 58, il ne permet pas la détection des bande S des mutant 54 – 58 et GA Cependant la protéine S est nécéssairement présente dans le surnageant car sans elle M et L ne seraient pas visible Le mutant P29 A presente un profil particulier. L faiblement synthétisé, et non secrétée, implication pour les études suivantes Enfin il est important de noter les portéine d’nevelope portant la mutation R79K sont correctement synthétisé mais ne sont pas détectables par cette technique. En conclusion… Mutants permissifs pour la sécrétion de PSV obtenus pour l’intégralité de la BCY-I.

32 La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HBV?
Transfection de cellules Huh-7 avec: pCIHBenv(-) pT7HB2.7 ou dérivé Analyse (J11) ADN HBV cellule surnageant : IP anti-preS1 protéines d’enveloppe surnageant : ELISA anti-HBs Nous avons par la suite mesuré l’effet des mutations dans la BCY-I (uniquemnt celle permissives pour la sécrétion des PSV) sur la maturation des virions HBV) Pour cela nous avons transfecté des cellule Huh-7 avec un plasmide portant un génome HBV deectif pur l’expression des protéine d’env Et un plasmide d’expression des 3 protéines d’enveloppe sauvage ou muté dans la bcy-I (montrer schema) 11 jours après tranfection, nous avons récolté les cellules et surn. La présence d’ADN dans les cellule a été recherché par SB ave une sonde spé du brin – La présence d’ADN viral dans le surngeant a été recherché Par SB anti brin - après IP anti preS1 de manière a exclure les capside non enveloppée sécrétéen abondance par la cellule par la cellule Les protéine d’enveloppe du surn ont été quantifiée par Elisa anti HBs Les mutation on été considérée permissibes qd le rapport entre la concentration en ADN virale et la concentration en Prot env dans le surn était conservé par rapport a celui du sauvage Mutation permissive quand le rapport ADN viral / protéines d’enveloppe dans le surnageant est conservé.

33 La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HBV?
ne contient pas de déterminant majeur de maturation HBV. Voici les résultat de l’expérience. Le panneau du haut réprésente la réplication de l’ADN viral dans les cellule Le panneau intermédiaire représente l’ADN viral dans le surn Le panneau du bas représente la concentration en protéine d’enveloppe dans le sup En présence de protéine d’enveloppe, la nucléocapside est recruté,et la production de virions mature a lieu, ce qui conduit a la détection d’ADN viral dans le sup En absence de protéine d’enveloppe, la maturation n’a pas lieu, et aucun ADN n’est détéctable. Les mutations peuvent etre répartis dans 2 groupe. Les mutation encadré sont les mutation permissives pour la maturation HBV pour lesquel des concentrations d’ADN et prortionnelle d’ADN et de protéines d’envdont détecté. La mutation P29A, qui est délétère pour la secrétion de L est logiquement délétère pour la maturation des virions HBV La mutation R79K est fortement délétère pour la sécrétion de PSV, mais la detection de trace d’ADN indique qu’elle n’est pas spécifiquement délétère pour la maturation HBV. En conclusion, la BCY-I n’a pas de fonction dans la maturation des virions HBV

34 La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV
La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV ? (démarche expérimentale) Transfection de cellules Huh-7 avec: pSVLD3 pT7HB2.7 ou dérivé Analyse (J12) ARN HDV (Cellules et surnageant) protéine d’enveloppe (Surnageant) Nous avons par la suite mesuré l’effet des mutations dans la BCY-I sur la maturation des virions HDV Pour cela nous avons transfecté des cellule Huh-7 avec un plasmide portant 3 copies du génome HDV Et un plasmide d’expression des 3 protéines d’enveloppe sauvage ou muté dans la bcy-I (montrer schema) 12 jours après tranfection, nous avons récolté les cellules et surn. La présence d’ADN dans les cellule et le surn a été recherché par SB ave une sonde spé de l’ARN génomque Les protéine d’enveloppe du surn ont été quantifiée par Elisa anti HBs Les mutation on été considérée permissibes qd le rapport entre la concentration en ARN virale et la concentration en Prot env dans le surn était conservé par rapport a celui du sauvage Mutation permissive quand le rapport ARN viral / protéines d’enveloppe dans le surnageant est conservé.

35 La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV?
ne contient pas de déterminant majeur de maturation HDV. Les résultats sont présenté sur le meme mode que dans l’étude de maturation HBV En présence de protéine d’enveloppe, des virions sont synthétisés,ce qui conduit a la détection d’ARN viral dans le sup En absence de protéine d’enveloppe, la maturation n’a pas lieu, et aucun ARN n’est détéctable. Les mutations peuvent etre répartis dans 2 groupe. Les mutation encadré sont les mutation permissives pour la maturation HBV pour lesquel des concentrations significatives et prortionnelle d’ADN et de protéines d’envdont détecté. La protéine L n’étant pas requise pour la maturation HDV, la mutation P29A n’était pas délétère De la meme facon que dans l’experience precedente, la mutation R79K est fortement délétère pour la secretion des PSV mais pas pour la maturation HDV En conclusion, la BCY-I n’a pas de fonction dans la maturation des virions HBV

36 La BCY-I a t-elle un rôle à l’entrée virale
La BCY-I a t-elle un rôle à l’entrée virale ? (modèle HDV) (démarche expérimentale) Normalisation des surnageants (ARN HDV) Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG) Détection de l’ARN HDV dans les cellules 7 jours après inoculation Mutation permissive quand la concentration en ARN HDV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage. Pour mesurer l’effet des mutations dans la bcy-I sur l’infectiosité des virions HDV, nous avons normalisé les surnageant de culture contenant les virions delta sur la base de leur contenu en ARN et nous avont inoculé des cellule HepaRG sensibles à l’infection pendant 16h en presence de PEG qui permet de potentialiser l’infection 7 jour après inoculation, nous avons testé les cellule pour la présence d’ARN G et AG par NB. Les mutations ont été considérées permissives quand la concentration en ARN HDV dans les cellules était comparable a celle observée pour le sauvage.

37 La BCY-I a t-elle un rôle à l’entrée virale ? (modèle HDV)
ne contient pas de déterminant majeur pour l’infectiosité HDV. Le panneau sup montre la quantité d’ARN dans les different incoculum après normalisation Les panneau inferieurs mmontre l’ARN detecté dans les cellules après inoculation. L’ARN ribosomique, qui s’hybride à la sonde spécifique de l’ARN antigénomque, sert de contrôle de dépôt Le Temoins positif formé par des virions HDV portant les protéine d’enveloppe sauvage, infectent efficacement les cellule, comme en temoigne la présence d’ARN génomque et AG dans les cellule, Les virions depourvu de protéine L sont non infectieux et servent de contrôle négatif. A l’execption des mutant P29A non infectieux car présentant un defaut d’expression de L , tous les mutants sont infectieux.. Dire la conclusion

38 Les résidus Trp de la BCY-II sont-ils impliqués dans la maturation HBV ?
Nous avons ensuite cherché a mesure l’impact de la triple mutation des W 196, -199, et -201 de la BCY-I en Alalnine sur la maturation des virions HBV. Ces résidus sont strictement conservés parmi l’ensemble des hépadnaviridaes, et il est donc raisonnable de penser qu’ils ai une fonction importante dans la maturation et/ ou l’infectiosité des virions HBV . Nous avons utilisé le meme protocole de transfection et d’analyse que precdement. Les protéines d’enveloppe sont correctement synthétisée et secrété sous forme de PSV, Et les niveau d’ADN viral observés indiquent que la maturation d’HBV n’est pas affecté par la mutation. Lire la conclusion. Les résidus W-196, -199, -201 de la BCY-II ne sont pas nécessaires à la maturation HBV.

39 Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale
Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale ? (modèle HBV) (démarche expérimentale) Normalisation des surnageants (ADN HBV) (dilution en série) Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG) Détection de l’ARNm HBV dans les cellules 12 jours après inoculation Pour étudier l’effet de la triple mutation sur l’infectiosité des virions HBV, nous avons utilisé une stratégie comparable aux test d’infections HDV. Nous avons normé les surnageants de culture contenant les virions HBV sur la base de leur contenu en ADN HBV Puis nous avons exposé des cellules hepaRG a des dilution successives des inoculum. 12 jour après inoculation, les cellules ont été testé pour la présence d’ARNm HBV par NB Les mutation ont été considéré comme permissive qd des concentration d’ARNm HBV comparable a celle du sauvage etait observé. Mutation permissive quand la concentration en ARNm HBV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage.

40 ne sont pas nécessaires à l’infectiosité HBV.
Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à l’étape d’entrée virale ? (modèle HBV) Nous pouvons voir que pour des concetration équivalente d’inoculum des signaux comparable d’infection sont observables pour le sauvage et le mutant, ce qui implique que: lire conclusion Les résidus W-196, -199, et -201 de la BCY-II ne sont pas nécessaires à l’infectiosité HBV.

41 Conclusion 1 La BCY-I ne contient pas de déterminant de maturation ni d’infectiosité HBV ou HDV. (Résidus Asp-33;Cys-48,-65,-69,-76;Tyr-72;Arg-73 non testés car leur mutation n’est pas compatible avec la sécrétion des PSV) Les Trp-196, -199, et -201, de la BCY-II n’ont pas de rôle dans la maturation et l’infectiosité HBV. Les conclisions de cette premiere serie d’experience sont que la BCY-I ne… Et que les résidus X… de la BCY-II ne Blanchet, M., et Sureau, C. (2006). J virol 80,

42 Déterminants d’infectiosité HDV et HBV
2ème partie Déterminants d’infectiosité HDV et HBV dans le domaine pre-S de L-AgHBs. La deuxieme partie des travaux a consisté en l’etude…

43 Démarche expérimentale
Production de virions HDV ou HBV exprimant L- et S-AgHBs (simplification du modèle par absence de M-AgHBs) Analyse et normalisation des surnageants Inoculation de cellules sensibles HepaRG ou de cultures primaires d’hépatocytes humains Recherche d’ARN HDV ou d’ARNm HBV dans les cellules inoculées Extérieur Membrane virale Domaine d’attachement matrice HBV (topologie interne) TLM 1 48 149 160

44 Mutants pre-S DA DM TLM Extérieur Membrane virale
Nous avons réalisé 2 series de mutations La première a consisté en une serie de deletion de 5 residus remplaces par un dipeptide KL entre les résidu 10 à 110 qui englobe en grande partie le domaine matrice HBV La deuxiel en des delétion de taille croissance verse l’extrémité Nt avec un point fixe en nt en position 153 Enfin nous avons réalisé une deletion de la sequence TLM identifié cmme impliquée a l’entré virale

45 Production des virions HDV
Nous avons ds un premier temps produit des virions portant soit les protéines S et L sauvages, soit mutés sur pre-S Les mutations présentées ici sont toutes permissives pour la synthèse de virions et permettent donc leur etude pour l’infectiosité Extérieur DA DM TLM 110 Les mutations sont permissives pour la production de virions HDV.

46 Le domaine pre-S1 contient-il des déterminants d’entrée virale HDV
Le domaine pre-S1 contient-il des déterminants d’entrée virale HDV ? (cellules HepaRG) Les résidus 11 à 75 sont impliqués dans l’infectiosité HDV. Les résidus 76 à 110 (contenant le DM) ne sont pas impliqués dans l’infectiosité HDV. Extérieur DA DM TLM 110 Comme nous pouvons le voir les mutations entre les résidus 11 et 75 sont délétères pour l’infectiosité, contrairement aux mutations places entre les residus è- et 110

47 Le PEG a t-il compensé une perte de fonction TLM?
La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale ? (HDV/HepaRG/PEG) La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infection en présence de PEG. Le PEG a t-il compensé une perte de fonction TLM? Extérieur DA DM TLM Pour mesurer l’effet de la suppression de la séquence TLM sur l’infectiosité HDV nous avons produit du virions et normé les surnageant et inoculé les cellules sensible en présence de PEG Comme nous pouvons le voir pour des concentration identique en virions, des signaux equivalents d’infection sont obtenu, ce qui indique que l’infection n’est pas altérée par la suppressionn du TLM, mais a ce stade nous n’avions pas la preuve que la suppression de la sequence ne pouvait pas etre compensé par la presence de PEG qui permettrai une forme de compensation, c’est pour cette raison que nous avons réalisé le test suivavnt

48 n’est pas délétère pour l’infection en absence de PEG.
La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale en absence de PEG ? (HDV/HepaRG) La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infection en absence de PEG. Extérieur DA DM TLM

49 Le TLM est-il nécessaire à l’entrée virale en culture primaire d’hépatocytes ?
DA DM TLM Extérieur La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infectiosité HDV en culture primaire d’hépatocytes.

50 La suppression du TLM est-elle délétère à l’entrée virale dans le modèle HBV ? (HepaRG)
DM TLM Extérieur La suppression du TLM n’est pas délétère pour l’infectiosité HBV en culture de cellule HepaRG.

51 Quelles sont les conséquences de grandes délétions pre-S sur l’infectiosité des virions ? (HDV/HepaRG) DA 80 97 107 115 153 DTM-I Nous avons également mesuré l’impact de mutations de taille croissante dans l’extrémité pre-S de L. Les protéines d’enveloppe ont été révélée par WB en absence ou en présence d’un traitement préalable à la PNG ase qui permet d’éliminer les carbohydrates des asparagines. Les inoculum ont été normés Les mutations et ne sont pas délétère pour l’infectiosité Ces resutat combinés aux précedent indiquent l’absence de determinant d’infectisité entre les residu 76 et 153 La perte de signal d’infection observé pour le mutant pourrait donc etre lié à un raccourcisement de la distance entre le domaine d’attachement au recepteur et le DTM –I Le mutant 80 – 153 présente une perte totale d’infectiosité. 3 hypothèse peuvent etre avancée pour expliquer ca phénomène: Cela pourrait s’expliquer par un raccoursissement de l distance La comparaison des blot des protéines en présence ou en absence de png ase indique une glycosylation anormale de l’ASN-4 de preS1 Cette glycosylation pourrait perturber l’interaction de preS avec le recepteur Par ailleur cette glycosylation est le temoin d’une translocation cotraductionnelle de pre-S Cette translocation rapide pourrait emecher la myristilation qui s’effectue dans le cyto L’absence de myrist suffirait a expliquer la perte d’infectiosité observée La taille des délétions semble influencer l’infectiosité : nécessité d’une distance minimale entre le domaine d’attachement au récepteur (DA) et le DTM-I ?

52 Conclusion 2 Les déterminants d’infectiosité du domaine pre-S de la grande protéine d’enveloppe sont confinés aux 75 premiers résidus N-terminaux. Une distance minimale semble requise entre le DTM I et le site d’attachement au récepteur. La conclusion de cette 2ieme serie de travaux est que. Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse.

53 Conclusion générale

54 Conclusion générale Maturation HBV: Maturation HDV: Infectiosité:
S-AgHBs assure le bourgeonnement. L-AgHBs permet le recrutement de la nucléocapside (Domaine matrice). Pas de rôle des BCY-I et –II dans le recrutement de la capside. Maturation HDV: S-AgHBs assure le bourgeonnement et possède un domaine matrice présent dans la BCY-II. Pas de rôle de la BCY-I. Infectiosité: déterminants communs entre HBV et HDV sur pre-S1 (75 premiers résidus N-terminaux). Pas de rôle des BCY-I et II, TLM, et DM. L’ensemble des travaux présentés ici nous permettent de conclure que

55 Modèle d’entrée virale
Attachement au récepteur résidus 1 à 48 (nécessité distance minimale avec DTM-I ?) Gripon, p., et coll. (2005). J virol 79, Barrera, A., et coll. (2005). J virol 79, Engelke, M., et coll. (2006). Hepatology 43, stabilisé par les résidus 49 à 75 ? Le Seyec, J., et coll. (1999). J virol 73, Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse. Endocytose Echappement des endosomes indépendante du pH Hagelstein, J., et coll. (1997). Virology 229, pas de fonction du TLM Contrairement à Stoeckl, L., et coll. (2006). PNAS 103, peptide fusion dans le DTM-I ? Grcacic, E., et coll. (2000). J virol 74, Etude en cours au laboratoire intervention des résidus 49 à 75 ? isomérisation des ponts S-S de la BAG ? Jaoude, G. A., et Sureau, C. (2005). J virol 79, Ces données, associées a celles présente dans la littérature, nous permettent d’imaginer un modèle d’entrée virale. La première étape est l’attachement au récépteur, qui est médié par les 48 premiers résidus de pre-S1. Les résidus 49 à 75 pourraient avoir un rôle dans la stabilisation de cette interaction. Les virions sont ensuite internalisé par endocytose selon u mode indépendant du pH. Les virions ou plutot, les capsides sortent ensuite des endosomes. Nous avons montré qu’il n’y a pas d’intervention de la séquence TLM lors de cet évenement, et il semble probable qu’un peptide fusion, localisé dans le DTM-I, permette le relarguage les capsides a partir des endosome. Il n’est pas exclu que la région 49 à 75 est un rôle à cette étape Il est également possible que l’isomérisation des pont dissulfures localisé dans la BAG participe au relarguarge

56 Perspectives

57 Perspectives Identification du récepteur
Préciser la fonction des résidus 49 à 75 de pre-S1 Préciser la fonction de la BAG Vérifier la transposabilité à HBV Les Trp de la BCY-II: sont conservés parmi les Orthohepadnavirus n’ont pas de fonction à l’entrée virale n’ont pas de fonction dans la maturation HBV  leur conservation est-elle imposée par l’ORF P ? Les perspectives sont nombreuse. Le récépteur spécifique de l’HBV reste a identifier Il est important également de préciser la fonction exacte des résidu 49 – 75 et Fonction de la BAG (en cour au labo dans le modèle delta) Verifier la transposabilité à l’HBV car s’il parait logique que de nombreux déterminants soient communs entre HBV et HDV (exemple attachement au recepteur, les séquences responsable du relarguage des structure interne (RNP et nucléocpside) pourraient varier d’un modèle à l’autre Par ailleurs, les W de la BCY-II sot conservés parmis les ortho, mais n’nt pas de role pour l maturation et l’infectiosité des virions HBV. Il serait interessant d’étidier les raisons de cette conservation L’une des raisons pourraient résider dans le chevauchement entre les cadres ouvert de lecture codant pour les protéines d’enveloppe et la polymérase virale. Effectivement, de manière a conserver l’intégrité du site actif de la polymérase virale, le résidu en position 196 sur S doit nécéssairement etre un tryptophane. Il serait dans ce cas possible que l’HDV est profité de cette contrainte en utilisant ce motif conservé pour assurer sa maturation.

58 Laboratoire de virologie moléculaire - INTS Georges Abou-Jaoudé
Isabelle Komla-Soukha Jessica Salisse Camille Sureau Laboratoire de Virologie transfusionnelle - INTS Rémi Caparros Inserm U271 Christian Trépo Olivier Hantz