TP Transformation d'une souche d'E. coli (HB 101) par le plasmide pGLO

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1 TP Transformation d'une souche d'E. coli (HB 101) par le plasmide pGLO
CIVEL / (JOFFIN) - ABM

2 Objectifs : - Réaliser la transformation de bactérie, en leur faisant ‘‘ingérer’’ un plasmide. - Utilisation d’un kit commercial Biorad® - Utilisation de milieux artisanaux type Paul Éluard

3 Activités : Préparation des milieux de culture nécessaire et revification de la souche d’E. coli. (2 méthodes) - Réalisation de la transformation - Mise en culture, pour visualiser l’efficacité de la manipulation

4 Origine de réplication (site EcoR1)
Gène du ……………… Répresseur de l’opéron arabinose Gène de la Protéine fluorescente avec promoteur/opérateur de l’opéron arabinose Gène de la ……………… bétalactamase

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7 TP sauce Paul Éluard (PE)
Pour 8 groupes ! TP biorad (B) TP sauce Paul Éluard (PE) Jour 1 Préparation de 8 milieux LB (B) Couler 16 milieux LB (PE) Ensemencement des bactéries sur 8 milieux LB (PE) + 8 milieux LB (B) + Autoclavage du reste du milieu LB Préparer et Couler 16 milieux LB Amp (PE) Préparer et Couler 8 milieux LB Amp/Ara (PE) Jour 2 Préparation des 8 autres milieux LB (B) et des 16 milieux LB Amp (B), et des 8 milieux LB Amp/Ara (B) Réaliser les tubes ''transformation'' et ''control'' - Ensemencer les boites LB Amp (B) + LB Amp/Ara (B), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (B) et LB (B), avec le tube ''control''. - Ensemencer les boites LB Amp (PE) + LB Amp/Ara (PE), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (PE) et LB (PE), avec le tube ''control''. Incuber à 37°C (à reproduire) B PE Jour 3 E coli + pGLO E. C oli - pGLO E. coli - pGLO LB Amp LB Amp/Ara LB Résultats

8 TP sauce Paul Éluard (PE)
Pour 8 groupes ! TP bioRad (B) TP sauce Paul Éluard (PE) Jour 1 Préparation de 8 milieux LB (B) Couler 16 milieux LB (PE) Ensemencement des bactéries sur 8 milieux LB (PE) + 8 milieux LB (B) Pas d'autoclavage / Travail sous PSM Préparer et Couler 16 milieux LB Amp (PE) Préparer et Couler 8 milieux LB Amp/Ara (PE) Préparation des 8 autres milieux LB (B) et des 16 milieux LB Amp (B), et des 8 milieux LB Amp/Ara (B) Jour 2 Réaliser les tubes ''transformation'' et ''control'' - Ensemencer les boites LB Amp (B) + LB Amp/Ara (B), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (B) et LB (B), avec le tube ''control''. - Ensemencer les boites LB Amp (PE) + LB Amp/Ara (PE), avec le tube ''transformation''. - Ensemencer les boites LB Amp (PE) et LB (PE), avec le tube ''control''. Incuber à 37°C (à reproduire) B PE Jour 3 E coli + pGLO E. coli - pGLO LB Amp LB Amp/Ara LB Résultats

9 Milieu de base LB Utiliser le bain d’eau (bouillonnant ?)
Préparation des milieux de culture (Biorad®) Milieu de base LB Utiliser le bain d’eau (bouillonnant ?) Bien agiter, bien homogénéiser

10 Préparation des milieux de culture (Biorad®) Ampicilline et Arabinose
Stérilement !

11 Ampicilline et Arabinose
Préparation des milieux de culture (Biorad®) Ampicilline et Arabinose Volume dans les boites : 12 mL

12 Préparation des milieux de culture (Paul Eluard®)
- À partir des milieux Columbia, couler 16 milieux LB - Puis préparer les milieux LB/Amp et LB/Ara + Amp, de façon similaire à la méthode Biorad®

13 Transformation (Biorad®)
Conservation dans la glace Conservation dans la glace

14 Transformation (Biorad®)
Choc thermique : 42°C, 50 secondes, puis dans la glace Conservation dans la glace

15 Rappels…

16 transformation

17 conjugaison

18 transduction