III. Substrats sonde pour l’étude des mécanismes enzymatiques CP450 (suite)

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1 III. Substrats sonde pour l’étude des mécanismes enzymatiques CP450 (suite)

2

3 CP450, mécanisme

4 Mécanisme concerté vs. 2 étapes
Pas de transposition allylique et rétention de configuration >90%

5 Mécanisme concerté vs. 2 étapes

6 Mécanisme concerté vs. 2 étapes
+

7 Horloges radicalaires

8 Horloges radicalaires
Pas de transposition

9 Nitroxyl radical coupling
K. U Ingold

10 Barton’s PTOC

11 Calibration d[R’]/dt = k1[U’] - k-1[R’] - k[R’][P]
k1[U’]/k[R’][P] - k-1[R’]/k[R’][P] = 1 k1[U’]/k[R’][P] = 1 k1 = k[R’][P]/[U’] k1 = k[R][P]/[U]

12 Calibration

13 CP450, mécanisme radicalaire?
d[U’]/dt = k[1] - kreb.[U’] - kR[U’] d[R’]/dt = kR[U’] - kreb.[R’] = 0 ; [U]/[R] = [U’]/[R’] kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = x 7/1 = s-1

14 Horloges radicalaires
Les rapides Les très rapides

15 Horloges radicalaires
<kOH<

16 Pourquoi cet écart? Mécanisme mal modélisé
2) Calibration des horloges pas présise 3) Effet stérique et effet de la protéine sur le réarraangement kOH = 1013 s-1

17 Il faut remettre les pendules à l’heure
<kOH<

18 Les horloges ne donnent pas la bonne heure!!!!!
s-1 > à la vitesse de décomposition d’un état de transition Trop rapide pour l’existence d’un intermédiaire

19 Et M. Newcomb propose un mécanisme avec un C+

20 A la recherche d’une horloge à C+

21 A la recherche d’une horloge à C+

22 A la recherche d’une horloge à C+

23 Mécanisme avec un ion carbénium?
1 à 3%

24 M. Newcomb persiste et signe
Si radical  temps de demie vie de s (trop court pour un intermédiaire) Si radical  rapport B/C plus grand Conclusion : mécanisme avec insertion directe de « OH » avec réaction secondaire

25 0.6%

26

27 Nouveau mécanisme

28 Effet isotopique kH/kD

29 Effet isotopique kH/kD

30 2 1

31 CP450, deux oxydants possibles

32 CP450, deux oxydants possibles
Insertion de « O » Hydroxylation Insertion de « OH » Responsable de la formation des produits transposés

33 CP450, deux oxydants possibles
Insertion de « O » Hydroxylation Insertion de « OH » Responsable de la formation des produits transposés

34

35 Epoxydation des oléfines

36 Substrat-suicide

37 Vérification des hypothèses appel à la biologie moléculaire
Mutant thréonine  Alanine (T303A)

38 Hydroxylation vs. epoxydation
FeV=O FeIIIOOH Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450 P450 T303A

39 Hydroxylation vs. epoxydation
FeV=O FeIIIOOH Vitesse de réactions nmole/min/nmole de P450 P450 T303A

40 Et avec les horloges? Hydroxylation

41 Hydroxylation des aromatiques, NIH shift

42 Hydroxylation des aromatiques, NIH shift

43 Et avec les horloges? Rapport R/U élevé Rapport R/U faible
Hydroxylation Rapport R/U élevé Rapport R/U faible

44 Effet isotopique kH/kD

45 M. Newcomb, le retour Pas de radical!!!!!!!

46 Comment Shaik arrive à réconcilier tout le monde

47 Shaik serait-il normand?

48 Low Spin vs. High Spin • HS LS

49 Calculs DFT

50 Low Spin vs. High Spin

51

52 CP450, mécanisme radicalaire?
fuite kreb. = kR[U’]/[R’] = kR[U]/[R] = x [U]/[R]

53 Oxydation des amines

54 Oxydation des amines

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