Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S

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1 A type VI Secretion System of Pseudomonas aeruginosa Targets a Toxin to Bacteria
Rachel D. Hood, P. Singh, F. Hsu, T. Günever, M. A. Carl, R. R. S. Trinidad, J. M. Silverman, B. B. Ohlson, K. G. Hicks, R. L. Plemel, M. Li, S. Schwarz, W. Y. Wang, A. J. Merz, D. R. Goodlett and Joseph D. Mougous Publié en janvier 2010 Hadj-Saïd Jessica

2 Pseudomonas aeruginosa
Pathogène opportuniste à large spectre d’hôtes patients brulés patients immunodéprimés Pseudomonas aeruginosa est une G-, une bactérie pathogène opprtuniste à large spectre d’hôtes, responsible de nombreuses infections nosocomiales chez l’homme et en particulier chez les patients brulés, immunodéprimés et ceux atteint de mucovisicidose. Les infections générés pas Pseudomoas aeruginosa peuvent être divisé en deux grands types: les infections aiguës caractérisé par la sécrétion de nombreuses toxines, et les infections chroniques caractérisés par la formation d’une communauté bactérienne persistante organisée en biofilm au niveau du site d’infection. Ces infections seraient en partie associé au système de sécrétion de type VI. mucoviscidose Infections aiguës Infections chroniques Système de sécrétion de type VI (Potvin et al. 2009)

3 Hcp Secretion Island-I (II ou III) encoded type VI secretion system
Le génome de la bactérie contient au moins 3 clusters de gènes codant pour les composants du système de sécrétion de type 6, nommé Hcp Secretioon Island- I II ou III. Il a été montré que HSI-I contribue à la pathogénicité de P.aerugionosa. (les mutants affectés dans ces clusters montre une atténuation des infections chroniques chez le rat) HSI-I : pathogénicité de P.aeruginosa (Potvin et al. 2009;Morgous et al. 2006)

4 Système de sécrétion de type VI
phosphoryle PpkA-Ƥ Fha1-Ƥ H1-SST6 activé déphosphoryle PppA Fha1 H1-SST6 inactivé HCP: Hémolysin Coregulated Protein hexamère Alors le système de sécrétion de type VI devient actif par la dimérisation de PpkA. Le signal environnemental responsable de cette dimérisation est encore inconnue, PpkA dimérisé s’autophosphoryle, puis il va phosphorylé la protéine Fha1, Fha1 phosphorylé va promouvoir l’activation du SST6 par un mécanisme inconnu. Néanmoins Mougous suggère la possibilité que Fha1 phosphorylé recruterait l’ATPase ce qui pourrait etre à la base de l’activation. La Stphosphatase, PppA a un effet antogoniste à ppkA puisqu’elle déphosphoryle Fha1 et cesse ainsi l’activité du système de sécrétion de type VI. Des études ont montré que les deux protéines sécrétées par le SST6 appartiennent essentiellement à deux familles: les protéines Hcp et VgrG Les protéiens Hcp sont des petites protéines formant des hèxamères, et il a été proposé que la fonction des hcp est de former des nanotubes sur la surface bactérienne et que ces tubes pourrait transporter d’autres substrats de SST6. Les prot VgrG partage un domaine avec la prot gp5 et un domaine avec la prot gp27, qui sont des composant de la queue d’un bactériophage, il a été proposé que les prot vgrG formerai un complexe trimérique et que ce complexe pourrait eter utilisé pour perforer les membranes bactériennes et autoriser le passage des substrats du SST6. Les protéines IcmF et Dot U sont les seuls protéines du système que l’on retrouve dans le système de sécrétion de type 4, la délètion du gène codant pour cette protéine provoque une diminution de la sécrétion de Hcp Hcp hemolysin coregulated protein, VgrG val gly rich nanotubes (Ballister, Mougous 2008) VgrG: Valine glycine rich G P gp5 gp27 (queue du bactériophage) (Leiman et al. 2009) trimère perforation des membranes bactériennes (Filloux et al. 2008)

5 Objectifs Comparer le sécrétome H1-T6SS fonctionnel (état ouvert)
H1-T6SS non fonctionnel (état fermé) Trouver de nouvelles protéines sécrétées par le H1-T6SS Donc les objectifs de cette article et de trouver des substrats de H1-T6SS qui serait responsable de la pathogénicité de la bactérie. Et de ce fait dans un premier temps on caractérise l’état ouvert ou l’état fermé du SST6. Et de les étudier (pathogénicité, cible)

6 Comment caractériser l’état ouvert et l’état fermé de H1-T6SS?
hcp1 vsv-g Fusion traductionnelle: Western Blot révélant Hcp1-V On sait que la protéine hcp est sécrété par le système de sécrétion de type VI donc on prend cette protéine pour caractériser l’état ouvert et fermé du SST6, pour révéler la protéine hcp sur Western Blot, on fusionne le gène hcp avec le gène codant pour l’épitope G du virus de la stomatite vésiculeuse car on a disposition des AC reconnaissant l’epitope G. Donc nous révélons hcp dans la fraction cellulaire, et dans le SN de différentes souches de Pseudomonas aeruginosa. Un contrôle de charge est réalisé avec un ac reconnaissant l’ARNpoly ce qui permet de vérifier que la quantité de protéine chargé est similaire dans tous les puits. La souche parentale ne sécrète pas de hcp. P ∆pppA a le H1-T6SS actif (état ON) ∆clpV1 a le H1-T6SS inactif (état OFF)

7 Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa
∆pppA H1-T6SS ON ∆clpV1 H1-T6SS OFF Pour identifier toutes les protéines sécrétés ils ont utilisé la technique de spectrométrie de masse qui permet de déterminer quelles protéines sont présentes dans le SN. Ils ont réalisé plusieurs fois cette manipulation, et à la fin ils ont réussi à identifier des protéines communes qui sont sécrétés par les deux souches, ils ont détecter des 5 protéines sécrétées uniquement dans l’état on, et trois dans l’état off. Ils se sont intéressés à ces 5 protéines qui seraient sécrété par le SST6. Le fait que ces protéines dans l’état off est susceptible de refléter les changements dans la régulation des gènes causé par la modulation de l’activité de H1-T6SS qui se manifeste dans le sécrétome. Ça serait l’une des conséquences du métabolisme d’avoir déléter un gène Sécrétomes Spectrométrie de masse Tse1 Tse2 Tse3 VgrG1 VgrG4

8 Deux protéines VgrG sont sécrétées par H1-T6SS
OFF vgrG vsv-g Fusion traductionnelle: Western Blot révélant VgrG1-V et VgrG4-V ON OFF Donc pour visualiser les protéines VgrG sur WB, on fusionne le gène VgrG avec le gène codant pour l’épitope G du virus de la stomatie vesiculeuse dont on a disposition des AC reconnaissant l’épitope G. Donc nous révélons les protéines VgrG1-V et VgrG4-V dans la fraction cellulaire et dans le SN de différentes souches de Pseudomonas aeruginosa. Dans la souche parental, les protéines VgrG sont peu ou pas sécrétés par rapport à la quantité dans la cellule, dans la souche où le SST6 est actif, les protéines sont sécrété, dans la souche où le SST6 st inactif, elles ne sont plus sécrétés, et quand on complémente cette couche avec le gène codant pour l’ATPase ClpV1, on restaure la sécrétion des protéines. Donc on en conclut que les VgrG sont bien exportés par le SST6. Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4, j’ai pensé que ces formes correspondaient à des multimères très stable et tres resistant de VgrG4 car ils ne sont pas dénaturer par le SDS, on pourrait croire qu’il y aurait dans la fraction cellulaire un monomère à 82kda, un dimère à164kda et un trimère à 246kda, ce qui n’est pas le cas dans le SN. L’équipe de M.Filloux a mis en évidence des complexes mulimériques où des VgrG serait associé avec d’autres VgrG qui auraient une taille différente ce qui pourrait expliquer que nous n’avons pas de multiples de 82kDA VgrG sont bien exportées par H1-T6SS Pour une raison inconnue on a plusieurs formes de VgrG4

9 Trois protéines Tse1, Tse2, et Tse3 sont sécrétées par H1-T6SS
vsv-g Fusion traductionnelle: Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V ON OFF Tse1-3: pas de sécrétion sans Hcp (composants) Tse1-3 sont bien exportées par H1-T6SS

10 Tse1-3 et VgrG: substrats ou composants du H1-T6SS ?
Western Blot révélant Hcp1-V ON OFF Sécrétion de Hcp en absence de Tse1-3 Tse1-3 sont des substrats Ce qui suggère que les VgrG ne sont pas que des substrats du SST6 mais aussi des composants de ce système. Pas de sécrétion de Hcp en absence de VgrG VgrG1 et VgrG4 sont des composants du H1-T6SS

11 Identification des protéines Tse1, Tse2, et Tse3
Microscopie à fluorescence (fusion clpV1-GFP) PpkA Fha1 phosphoryle déphosphoryle PppA SST6 activé ClpV1 n’est plus produite en absence de la kinase PpkA ∆tse1-3 n’empêche pas la présence de ClpV1 Tse1-3 sont des substrats

12 La voie Gac/Rsm est-elle impliquée dans la sécrétion des Tse?
Western Blot révélant Tse1-V, Tse2-V, Tse3-V ON OFF P H Nterm Cterm D Senseur: GacS (GDR Pseudomonas , Patrick Plesiat ) Régulateur de réponse: GacC RetS La voie Gac/Rsm est impliqué dans la virulence de P.aeruginosa. Gac est un régulateur à deux composants, constitué d’un senseur GacS et d’un régulateur de réponse GacC, quand le senseur détecte un signal, il s’autophosphoryle et transfert son phosphate sur GacC, la synthèse de l’ARN non codant RsmZ est activé, RsmZ en adoptant une structure en tige boucle à la capacité de se fixer sur la protéine RsmA. RsmA non associé à RsmZ active le SST3 et inhibe la sécrétion de matrices exopolysaccharidiques,et donc par conséquent le biofilm. Le système à deux composants est réprimé par RetS. Etant donnée que nous voulons savoir si cette voie est impliqué dans la sécrétion des Tse, on suit ces protéines sur Western Blot dans la fraction cellulaire et dans le SN de différentes souches de P.aeruginosa. Un contrôle de charge est réalisé avec un Ac reconnaissant l’ARNpoly ce qui permet de vérifier que la quantité de protéine chargée est similaire dans tous les puits. Dans la souche parental, il n’y a pas de sécrétion de prot Tse, dans la souche où le SST6 il y a une très faible production de tse dans la fraction cellulaire, et il n’y a pas de sécrétion de Tse, or dans l’expérience précédente on avait la sécrétion des tse dans ce même mutant, ceci est expliqué par le fait qu’ ils ont chargé beaucoup moins de protéines dans ce WB que dans celui-ci , car le mutant délété du gène codant pour le représseur RetS produit énormement de Tse et si on avait chargé la même quantité de trop protéines le WB n’aurait pas été lisible. Donc le mutant retS signifie que la voie Gac/Rsm est active, que rsmZ bloque RsmA, et la sécrétion de matrice expolysaccharides n’est plus inhibé. Donc on en conclut que l’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et par conséquent la sécrétion des Tse. La concentration cellulaire des tse(plus particulièrement de tse1) est tellement importante que la bactérie pourrait sécrété les protéines par un autre système de sécrétion, l’expérience du double mutant indique que la sécrétion des tse se fait toujours uniquement par le système de sécrétion de type 6 puisqu’il n’y a pas de sécrétion quand H1-T6SS est inactif ON L’activation de la voie Gac/Rsm augmente la production et la sécrétion des Tse1-3 Synthèse de RsmZ (ARN non codant) RsmA Tse1-3 toujours sécrétées par le H1-T6SS SST3 Biofilm

13 Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2
Hyp: locus tse2 tsi2 essentiel pour la viabilité de l’organisme ∆tsi2 Tse2 Tsi2 (+) Vecteur avec tse2 (-) Vecteur contrôle Inductible à l’IPTG tse2 A présent ils s’intéressent à tse2 et à un autre gène juste à côté, tsi2. D’après la librairie d’insertion de transposons de Pseudomonas aeruginosa, ce locus ne contient pas de séquence d’insertion de transposons, donc il suppose que cette ORF serait essentielle pour la viabilité de l’organisme. Ils n’ont pas réussi à obtenir des mutants déléter de tsi2 ce qui indiquerait que c’est tsi2 qui serait essentielle pour l’organisme. Donc pour tester cette hypothèse: ils visualisent la croissance de différents souches de pseudomonas aeruginosa sur boites de pétri. Nous avons la souche parentale qui produit les protéines Tse2 et Tsi2, et le double mutant ∆tse2 et ∆tsi2 qui ne produit donc pas cew prtoéines, un plasmide contenant le gène tse2 est inséré ici et ici, un vecteur contrôle est inséré ici. Quand on induit le vecteur à l’IPTG, on a la protéine Tse2 qui est produite et qui inhibe la croissance de la souche on en conclut que c’est une protéine toxique, en revanche la croissance de la souche parentale n’a pas été inhibé donc on en conclut que la protéine tsi2 est une protéine d’immunité d’où son nom « TypeVI Secretion Immunity protein 2 ». Transposons:Éléments génétiques mobiles d’ADN. Inhibition de la croissance P.aeruginosa protéine toxique Tse2 Tsi2 tsi2 protéine d’immunité Type VI Secretion Immunity protein 2 Tse2 seul

14 Interaction des protéines Tse2 et Tsi2
Bactérie (culot) tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Lyse (sonication) ultra Fraction membranaire (culot) Fraction solubles (SN) Cytoplasme + périplasme Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Donc ils se demandent si les protéines interagissent physiquement entre elles. Pour déterminer cela, ils font une coimmunoprécipitation dans P.aeruginosa. On centrifuge une culture de bactérie de P.aeruginosa d’une souche où le gène tse2 a été fusionné à un bout du gène codant pour la glycogen synthase kinase (GSK) et d’un autre souche où on retrouve cette fusion avec la protéine tse2 et cette fois-ci le gène tsi2 a été fusionné avec le gène codant pour l’épitope G du virus de la stomatite vésiculeuse. Donc on centrifuge les deux cultures, on récupère le culot donc les bactéries, on les resuspend, on les éclate, puis on fais une ultracentrifugation pour séparer la fraction membranaire de la fraction soluble. On récupère la fraction soluble qui contient toutes les protéines solubles, et on réalise un western blot avant de faire la coimmunprécipitation. Dans cette colonne a été mis l’extrait cellulaire de cette souche, et là celle de cette souche. L’Ac anti VSV-G ne reconnait pas la prot Tsi2 ce qui est normal puisque qu’elle n’a pas l’épitope G, mais ici elle reconnait Tsi2-V. L’anticorps anti GSK reconnait tse2-GSK dans les deux extraits. A present on réalise la coimmunoprécipitation, nous avons notre extrait cellulaire dans des tubes eppendorf, on rajoute des billes d’ agarose couplé à l’AC anti VSV-G

15 Interaction des protéines Tse2 et Tsi2
Caractérisation des protéines Tse2 et Tsi2 Coimmunoprécipitaion de Tsi2-V et Tse2-GSK Western Blot révélant Tse2-GSK et Tsi2-V tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Bille d’agarose couplé à l’Ac anti-VSV-G tsi2 tse2-GSK tsi2-V tse2-GSK Tsi2 Tsi2-V Tse2-GSK A present on réalise la coimmunoprécipitation, nous avons notre extrait cellulaire contenant toutes les protéines solubles dans des tubes eppendorf, on rajoute des billes d’ agarose couplé à l’AC anti VSV-G, on incube pendant 2h à 4°C. Ils font des lavages pour enlever toutes les protéines qui ne se sont pas fixé au bille d’agarose et pour enlever aussi des interactions non spécifiques. Ensuite ils éluent les protéines reconnues par l’AC anti VSV-G, et ils font un Western blot des protéines élués sur un gel SDS donc on va enlever l’interaction entre les deux protéines si interaction il y a. Donc ici les Ac ne reconnaissent aucunes protéines ce qui est normale puisque la prot Tsi2 n’est pas fusionnée avec l’épitope G. En revanche ici Tsi-V est reconnu par son ac, et la protéine tse2-GSK est aussi présente, donc on en conclut qu’il ya une interaction directe entre les deux protéines. Autres protéines Interaction directe entre Tsi2 et Tse2

16 Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes?
Cellules eucaryotes : Saccharomyces cerevisiae DO=1 DO=0.5 DO=0.25 DO=0.13 DO=0.06 DO=0.03 DO=1↔ cellules.mL-1 Maintenant ils veulent savoir si la toxine Tse2 agit sur les cellules eucaryotes, Saccharomyces cerevisiae a été transformé par un plasmide contenant le gène tse1, tse2, tse3 ou le vecteur vide inductible au galactose. On a une culture de Saccharomyces qui a été resuspendu dans de l’eau à une densité optique de 1, cette culture est dilué en série 5fois. On fait pousser ces cultures sur des plaques contenant du glucose ou du galactose. Elles sont incubés à 30°C pendant 2 jours avant d’être photographié. Et on s’aperçoit que l’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies, ce qui n’est pas le cas des autres tse. On refait la même expérience avec un plasmide contenant le gène tse2 et tsi2, et on s’aperçoit que la coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau similaire au contrôle, la toxicité de Tse2 est annulé en rajoutant la protéine Tsi2. Ils ont aussi regarder l’effet de Tse2 sur des cellules HeLa, et il en conclut que Tse2 a un effet délétère sur les cellules eucaryotes. Coexpression de tsi2 et de tse2 restaure la viabilité à un niveau similaire au contrôle L’expression de tse2 diminue dramatiquement le nombre de colonies Tse2 intracellulaire a un effet délétère sur les cellules eucaryotes (S. cereviae, HeLa.)

17 Tse2 agit-elle sur les cellules eucaryotes?
GFP tse Cellules humaines HeLa Cytométrie de flux Microscopie à fluorescence Cytométrie de flux L’expression de tse2 augmente le % de cellules rondes L’expression de tse2 diminue la fluorescence Tse2 a un effet délétère sur les cellules eucaryotes.

18 Tse2 agit-elle sur les cellules procaryotes?
Escherichia coli Burkholderia thailendensis Donc puisque Tse2 agit à l’intérieur de cellules eucaryotes, ils regardent si il agit à l’intérieur de cellules procaryotes, notamment sur E.coli et sur Burkholderia thailendensis. Donc ils observent la croissance de ces deux bactéries sur des boites de pétri.E.coli est transformé par un plasmide contrôle, par un plasmide contenant les gènes tse2 et tsi2 ou bien tse2 seul, plasmide inductible à l’IPTG, même expérience pour Burkolderia thailendensis. Après 1 jour ou deux jours d’incubation pour burkolderia (car elles poussent plus lentement) on photographie les boites de pétri. Et on s’aperçoit que la souche qui contient seulement le gène tse2 ne pousse pas. L’expression de tse2 seul inhibe la croissance bactérienne La protéine Tsi2 protège la bactérie de Tse2

19 Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS
P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le H1-T6SS? Mesure de la cytotoxicité de différentes souches P.aeruginosa sur des HeLa PAO1 : Tse2 non sécrétée Haute cytotoxicité ∆retS : Tse2 hypersécrétée ∆retS ∆ClpV1 : Tse2 non sécrétée Basse cytotoxicité Donc la toxine peut agir sur les cellules eucaryotes et procaryotes , et nous nous demandons si P.aeruginosa peut utiliser la toxine Tse2 contre les cellules eucaryotes via le H1-T6SS. Donc nous mesurons la cytotoxicité de différentes souches bactériennes sur des cellules HeLa en suivant par absorbance l’activité d’un enzyme la Lactate Déshydrogénase dans le SN. La LDH est une enzyme exclusivement cytoplasmique, donc l’augmentation de son activité dans le SN permet de détecter une altération de la perméabilité membranaire des cellules HeLa. La souche de Pseudomonas aeruginosa PA14 a une haute cytotoxicité tandis que celle de E.coli est basse, elle est considéré comme un contrôle non cytotoxique. La souche parentale a 35% de cytotoxicité, ∆retS où tse2 est hypersécrété, a une cytotoxicité plus faible que la souche PAO1 qui ne sécrète pas de Tse2, donc tse2 n’a aucun effet cytotoxique sur les cellules eucaryotes, on en conclut que Tse2 n’est pas injecté dans les cellules HeLa car Tse2 intracellulaire à une effet délétère sur ces cellules et on aurait obtenu une cytotoxicité bien plus importante, et la sécrétion de Tse2 via le SST6 dans l’environnement des cellules HeLa n’a aucun effet cytotoxique. La souche délété de retS et de tse2 a le même niveau de cytotoxicité. Le double mutant retS et ClpV1, où le SST6 est inactif a la même cytotoxicité de la souche qui hypersécrète tse2, c’est deux expériences confirme donc bien que Tse n’est pas toxique pour les cellules eucaryotes. Pas de cytotoxicité provenant de la protéine Tse2 via le H1-T6SS Tse2 n’est pas injectée par le H1-T6SS Tse2 extracellulaire non cytotoxique

20 Tse2 impacte la croissance
P.aeruginosa peut-elle utiliser la toxine Tse2 contre les cellules procaryotes via le H1-T6SS? Expérience de croissance compétitive entre ≠ souches de P.aeruginosa Milieu solide Milieu liquide ∆retS : Tse2 hypersécrétée Tse2 impacte la croissance de la souche receveuse (dénuée de Tsi2) Est-ce pareil pour les cellules procaryotes? Pour le savoir on réalise une expérience de croissance compétitive de deux souches de pseudomonas aeruginosa sur milieu solide, ou liquide. On met une souche donneuse (qui a donner la protéine tse2) et une souche receveuse (qui va recevoir la protéine Tse2). Initialement on rajoute la même quantité de donneuses que de receveuses donc on a un ration de 1. 5h après sur milieu solide, dans le contrôle où on a la présence des deux même souches ∆rets où Tse2 est hypersécrété, il n’y a pas de compétition, Ici la quantité de bactérie ∆retS est 14X supérieur à la souche qui n’a pas la protéine d’immunité tsi2 ni tse2.Si on complément cette souche ave le gène tsi2, il n’y a plus de compétition entre les deux souches. Ici la souche n’a plus d’ATPase, il n’y a pas de sécrétion de Tse2, donc il est sécrété que par ce système de sécrétion. Quand on complément ce mutant avec ClpV1, la souche donneuse est 6x plus présente que la souche receveuse, donc on restaure la compétition. Ici la souche n’a plus de Tse2, donc il n’y a plus de toxines pour inhiber la croissance de la souche donneuse. 5h après dans le milieu liquide, il n’y a pas de compétition quelques soient les souches présentes. Donc on en conclut qu’un contact entre les cellules donneuses et receveuse est nécessaire. Ce qui est dommage c’est qu’ils n’ont pas fait cette compétition avec E.coli ou burkolderia comme c’était le cas tout à l’heure. ∆retS ∆clpV1 ∆retS ∆clpV1 +clpV1 ∆retS ∆tse2 ∆retS ∆retS ∆retS Tse2 requiert un H1-T6SS fonctionnel ∆retS Nécessité d’un contact cellulaire donneur-receveur

21 Conclusions VgrG1, VgrG4 sont des composants H1-T6SS
Tse1, Tse2 et Tse3 sont des substrats du H1-T6SS L’activation de la voie Gac/Rsm, qui active la formation de biofilm, augmente la quantité des Tse. Tsi2, la protéine d’immunité, permet à l’organisme de se protéger de Tse2 Donc on pourrait penser que le système de sécrétion de type 6 pourrait être important dans le scénario impliquant des cellules immobiles, tel que les cellules d’un biofilm. Le H1-T6SS pourrait être un mode d’interaction, de communication entre les pseudomonas, et il tuerait les autres bactéries. Pseudomonas forme un biofilm chez les patients atteints de mucoviscidose, et ils ont observé que l’expression du SST6 et son activation étaient élevé dans ce biolfilm, il est donc possible que ça soit la protéine tse2 qui joue une rôle dans la prépondérance ce P.aeruginosa dans le poumon. Ce qui suggère que H1-T6SS serait important dans la virulence d’un biofilm. Tse2 intracellulaire inhibe la croissance de cellules eucaryotes et procaryotes H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les cellules eucaryotes H1-T6SS est incapable d’injecter Tse2 dans les souches de Pseudomonas aeruginosa sans établir un contact Biofilm

22 Conclusions et Discussions
H1-T6SS : mode de communication entre P.aeruginosa Vie: C’est une P. aeruginosa P.aeruginosa Tse2 Mort: C’était une autre bactérie Donc on pourrait penser que le système de sécrétion de type 6 pourrait être important dans le scénario impliquant des cellules immobiles, tel que les cellules d’un biofilm. Le H1-T6SS pourrait être un mode d’interaction, de communication entre les Pseudomonas aeruginosa, P.aeruginosa injecte la toxine dans une bactérie, elle vie Pseudomonas aeruginosa reconnait qu’elles sont de la meme espèce, elle meurt c’est une autre bactérie. Et ceci expliquerait pourquoi Pseudomonas aeruginosa a une telle capacité d’adaptation en présence d’autres bactéries. Comme c’est le cas chez les poumons des patients atteints de la mucoviscidose, et ça pourrait expliqué pourquoi l’expression et l’activation élevé du H1-T6SS est observé dans des isolats de patients atteint de mucoviscidose. (car le jour où il y aura une mutation sur H1T6SS permettant d’injecter dans les cellules eucaryotes, on connaitra la cible de Tse2 ce qui nous aidera pour concevoir des AB) (Russell & Mougous, juillet 2011) Expression et activation du SST6 sont élevées dans les isolats de patients atteint de mucoviscidose (Yahr, 2006) H1-T6SS : capacité d’adaptation (fitness) en présence d’autres bactéries.

23 Cellule bactérienne receveuse Hcp Modèle hypothétique
Cytoplasme Tse2 Membrane interne Tse3 Cellule bactérienne receveuse Pepdidoglycane Tse1 Membrane externe Hcp Modèle hypothétique Membrane externe Tsi1 Cellule bactérienne donneuse Pepdidoglycane Tsi3 Membrane interne Tse2 Tsi2 Cytoplasme Tse3 Tsi2-Tse2 VgrG Tse1

24 Perspectives Sur quoi Tse2 agit dans les cellules eucaryotes et les cellules procaryotes Pourquoi H1-T6SS ne peut pas injecter ses toxines dans des cellules eucaryotes

25 Merci de votre attention

26 Abondance des protéines selon l’état ouvert ou fermé
Protéines communes aux deux états Hcp sécrété par autre système

27 Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa
Digestion trypsique Sécrétome Spectromètre de masse Non Communes État on (∆pppA) État off (∆clpV1) État on/off R1 R2 Communes Total 300 262 249 65 314 19 14 5 30 35 14 18 3 26 29 Ce qui nous intéresse ceux sont les protéines qui sont sécrété quans le système de sécrétion est sur on

28 Comparaison des sécrétomes des mutants de P.aeruginosa
∆pppA ∆clpV1 300 prot 19 prot 14 prot ON OFF ∆clpV1 Donc il y aurait 300 protéines communes dans le réplicat 1 Et 262 protéine dans le réplicat 2, mais il y’en aurait que 249 communes les 65 autres serait du à un mauvais screenage des peptides au spectromètre de masse ∆pppA VgrG4 VgrG1 Tse1 Tse2 Tse3 262 prot 371 protéines 18 prot 14 prot

29 P.aeruginosa peut viser les cellules bactériennes mais pas eucaryotes avec Tse2
Compet sur long terme Ils mettent 10x plus de cellules donneuses que de cellules receveuses pour augmenter la probabilité de contact Les souches donneuses Tse montre encore une fois un avantage de croissance sur les cellules receveuses qui n’ont pas Tsi2 Milieu liquide