Université F. Rabelais, Tours

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1 Université F. Rabelais, Tours
La double vie d’un virus fascinant impliqué dans des interactions hôtes-parasites chez les insectes Elisabeth Huguet Institut de Recherche sur la Biologie de l’Insecte Cours M2 Recherche Infectiologie cellulaire et moléculaire, Vaccinologie UES3-1 Santé Publique Septembre 2008 Université F. Rabelais, Tours UMR CNRS 6035 France

2 Cotesia congregata parasite la chenille Manduca sexta

3 Conséquences du parasitisme
X Arrêt du développement Immunosuppression Cotesia congregata (Guêpe Braconidae) Manduca sexta

4 Implication d’un troisième partenaire ?
X Arrêt du développement Immunosuppression Manduca sexta Cotesia congregata bracovirus Cotesia congregata (Guêpe Braconidae)

5 Le virus est indispensable à la réussite parasitaire
Oeufs de guêpe lavés (sans virus) Oeufs de guêpe + Virus Oeufs de guêpe + Virus + psoralène Blocage expression virus (Beckage et al,1994) (Edson et al, 1981)

6 Le virus existe sous deux formes …
1. Une forme virale « libre » constituée de multiples cercles d’ADN double brin Virus DNA MW FIGE 2.5 kb 7.5 kb 5 kb 10 kb 25 kb 20 kb 15 kb 40 kb 35 kb 30 kb 45 kb Cette forme est présente en large excès dans les ovaires des femelles guêpes

7 Le virus existe sous deux formes …
Sonde ADN viral « EP1 » Taille attendue 5 kb ADN guêpe 5 kb Sonde ADN viral « EP1 » Signal non attendu !

8 Le virus existe sous deux formes …
1. Une forme virale linéaire intégrée au génome de la guêpe Expériences d’hybridations in situ sur chromosomes de guêpes PV4 PV10 EP1 1 2 3 4 5 7 8 10 6 9  Belle et al., 2002

9 Le virus existe sous deux formes …
Dans la guêpe : Transmission verticale à la descendance Réplication Peu d’expression des gènes viraux Dans la chenille : Pas d’intégration dans le génome PAS de réplication Expression forte des gènes viraux

10 Cotesia congregata bracovirus est indispensable
à la réussite parasitaire de la guêpe Réplication virale 5 Oviposition Injection de virus Dérégulation de la physiologie de l’hôte Succès parasitaire de la guêpe Expression des gènes viraux Production de protéines virales

11 Cycle du bracovirus de Cotesia congregata
Génome intégré (chromosome 5) Succès du parasitisme Cellules ovariennes de C. congregata Production des cercles viraux Protéines de capsides Formation virales Alteration du developpement Alteration de l’immunité REPLICATION & MORPHOGENESE VIRALES EXPRESSION DES GENES DE VIRULENCE Expression des gènes viraux Manduca sexta Injection des particules virales

12 Symbioses : mutualisme/parasitisme
Virus qui joue un rôle central Association mutualiste Avec une guêpe Association parasitaire Avec une chenille Sans le virus la guêpe ne peut pas assurer sa descendance Sans la guêpe le virus ne peut pas se répliquer et se transmettre : virus ayant perdu son autonomie

13 Associations virus-guêpes
Bracovirus Ichnovirus > espèces de guêpes Braconidae > espèces de guêpes Ichneumonidae

14 35 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Complexe Microgastroïde
Deux familles de virus associées à deux familles de guêpes 35 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Ichneumonidae Campopleginae Banchinae 14000 espèces Ichneumonoidae Ichnovirus 34 sous familles qui ne possèdent pas de PDV Braconidae Complexe Microgastroïde (7 sous familles) 17000 espèces Bracovirus Origine indépendante de l’association virus-guêpe chez les guêpes Braconidae et Ichneumonidae

15 Origine des associations guêpes braconidae-virus
Virus ancêtre >17000 espèces Meteorinae Macrocentrinae Aphidiinae Opiinae Alysiinae Doryctinae Braconinae BRACONIDAE MICROGASTRINAE Miracinae Cheloninae Cardiochilinae MICROGASTRINAE-Cotesia Guêpe ancêtre (70 millions d’années)

16 Les questions scientifiques
Quel est la nature du virus ancêtre ? BRACONIDAE Virus ancêtre Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ?

17 Les stratégies utilisées
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Séquençage du génome viral libre Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

18 Séquençage de la forme libre du virus
Génome de C. congregata Bracovirus (CcBV) 30 cercles d’ADN db 567 kb 27 % de régions codantes 156 gènes potentiels Organisation en familles multigéniques Espagne et al. Science 2004

19 Contenu du génome de CcBV

20 Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ?
Très peu de gènes « viraux » 1 gène de baculovirus 1 gène d’ascovirus gènes de rétroéléments DIRS et Dong gènes de polintons Ne renseignent pas sur la nature du virus ancêtre

21 Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ?
Familles multigéniques à motifs conservés: Protéines-Tyrosine-Phosphatases Inhibiteurs NFKB : IKB Cystatines Protéines riches en cystéines Potentiellement de nombreux facteurs de virulence impliqués dans dérégulation de la physiologie de la chenille

22 Digestion enzymatique
Analyse des gènes exprimés par reverse northern. Protéines Tyrosines Phosphatases Inhibiteurs NFKB Cystatines Découpage Clonage séquençage ADN viral Digestion enzymatique Sonde P32 d’ADNc chenilles non parasitées Sonde P32 d’ADNc chenilles parasitées

23 Gènes de la famille des IκB
Gènes codant pour protéines IκB interviennent dans la régulation de la réponse immunitaire innée chez les mammifères et les insectes (voies Toll) Interaction avec le facteur de transcription NF- κB Motif présent dans toutes les protéines IκB : domaine de répétitions ankyrines Gènes IκB-like chez les bracovirus et ichnovirus 9 gènes IkB chez CcBV

24 Voie Toll chez la Drosophile
Bacteries Gram+ Champignons Toll Tube IkB (Cactus) Pelle NFkB (Dorsal) Activation de peptides antimicrobiens noyau

25 Modèle du mode d’action des IkB viraux sur l’immunité chez Manduca
Reconnaissance guêpe parasite Toll-like IkB NFkB Activation de la réponse antiparasitaires noyau

26 Modèle du mode d’action des IkB viraux sur l’immunité chez Manduca
Reconnaissance guêpe parasite Toll-like IkB viraux Injection de CcBV IkB NFkB X Pas d’activation de gènes de l’immunité noyau

27 Contenu du génome de CcBV Nature du virus ancêtre ?
Familles multigéniques à motifs conservés: Protéines-Tyrosine-Phosphatases Inhibiteurs NFKB : IKB Cystatines Protéines riches en cystéines

28 Implication des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?
1 3 2 Cercle 19 3 Cystatines

29 Cystatines ? QxVxG PW G Cibles des cystatines :
Cystatines = inhibiteur de protéases à cystéine Cystatines de type 2 Première description de cystatines virales Chez les nématodes parasites les cystatines sont des facteurs de virulence G QxVxG PW Cibles des cystatines : protéases à cystéine de la famille C1 Ex : papaine et cathepsine

30 Cystéine protéases ciblées chez les insectes ?
Protéases à cystéine (type C1) des insectes : Digestion Développement (métamorphose et mue) Immunité ? 26/29 kDa C1 cysteine protease CathepsinB Cathepsin L Libération De protéase Surexpression (ARNm) Sarcophaga Mouche tsetse Drosophile

31 Quel est le rôle des cystatines virales dans l’interaction hôte-parasite ?
Evolution moléculaire des cystatines virales Est-ce que les cystatines virales sont exprimées ? Les cystatines virales sont-elles des protéines inhibitrices fonctionnelles ? Quelles sont les cibles des cystatines virales chez Manduca ?

32 Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite
Analyse par Northern Corps gras Hémocytes ARNm cystatines ARNm actine

33 Les cystatines sont fortement exprimées pendant l’interaction hôte-parasite
Analyse par Western Hemolymphe P NP 16,5 32,5 25 KDa Cystatines (13 kDa) Anticorps Anti-Cystatine1

34 Expression et purification d’une protéine recombinante Cystatine 1
Expression de CcBV cystatine1 dans des cellules d’insectes Hi5 Purification sur colonne de papaïne Fractions élution Cystatine 1

35 S. peregrina 29 kDa cysteine protease
CcBV Cystatine 1 recombinante est un inhibiteur de protéases à cystéine actif Papain Relative Activity (%) Cystatine 1 (nM) Cystatine 1 (nM) Relative Activity (%) Cathepsin B Cathepsin L S. peregrina 29 kDa cysteine protease Espagne et al. Journal of Virology 2005

36 Modèle de travail _ Perspectives
Parasitisme Œufs de guêpe + bracovirus Production de protéases à Cystéine Inhibition par les cystatines de CcBV ? Nouvelle composante de la réponse immunitaire des insectes ?

37 Les questions scientifiques
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Séquençage du génome viral libre ? Analyse d’une banque d’ADNc à partir de chenilles parasitées Reverse Northern en utilisant comme sonde de l’ADNc de chenilles parasitées

38 Nature du virus ancêtre ?
Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes Chromosome 5 guêpe Pas de réplication dans la chenille hôte Les gènes viraux n’ont pas besoin d’être codés par les cercles Les gènes viraux sont exprimés massivement dans les ovaires Les gènes viraux sont dans le génome de la guêpe ?

39 Nature du virus ancêtre ? Nouvelle stratégie
Réplication virale: massive dans les ovaires de guêpes 1. Recherches de protéines virales (capside, polymérase, enveloppes) Par une approche transcriptomique et protéomique sur les ovaires -banque EST d’ovaires de guêpes -analyse des protéines à partir de virus purifiés des ovaires 2. Analyse de la forme intégrée du virus

40 44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte)
Analyse du transcriptome d’ovaires répliquant le virus: 6000 EST d’ovaires de Cotesia congregata Comparaison dans les banques de données Identification des protéines de structure des virions: Séquençage des protéines constitutives des particules purifiées Comparaison dans les banques de données et les banques d’EST 44 gènes viraux potentiels (origine virus d’insecte) Gènes impliqués dans la transcription La constitution des nucléocapsides La constitution des enveloppes des particules Gènes viraux sont intégrés au génome de la guêpe

41 Le génome du virus reflète les contraintes évolutives différentes : mutualisme/parasitisme
1. Intégration du virus ancêtre 3. « Acquisition de gènes de virulence» Transfert du génome de la guêpe vers le virus 2. « Perte de gènes viraux » Transfert vers le génome de la guêpe

42 Encore beaucoup de questions
Comment est-ce que le virus dérégule la physiologie de la chenille ? Mécanismes ? Quel est la nature du virus ancêtre ? Comment s’effectue la réplication ? Virus comme vecteur de transfert de gènes ? Capture des gènes et évolution ?