Bases microbiologiques pour les cliniciens

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1 Bases microbiologiques pour les cliniciens
Dr Joaquim MATEO Département d’Anesthésie Réanimation SMUR Hôpital Lariboisière, Paris

2 Microbiologie clinique
ORIENTATION DIAGNOSTIC ET THERAPEUTIQUE LIEN OBLIGATOIRE AVEC LE LABORATOIRE Compétence Alerte Equipement, médecins, recherche Responsabilité conjointe partenariat INTERET MAJEUR Structure de la bactérie / implications cliniques Diagnostic en microbiologie clinique Traitement antibiotique Résistance aux antibiotiques Dosage d’antibiotique ECOLOGIE ET EPIDEMIOLOGIE BACTERIENNE EN REANIMATION

3 Pathologie infectieuse et anesthésie réanimation
Pathologie omniprésente Chirurgie septique, choc septique Complications chirurgicales postopératoires Médical Environnement Antibioprophylaxie Infection nosocomiale hygiène

4 Qualité : paramètre d’évaluation
Antibiothérapie : contrôle et coût Écologie bactérienne à l’hôpital Transmission des bactéries multirésistantes Taux d’infections nosocomiales « AAA »

5 Intérêt du diagnostic précis et du traitement précoce et adapté des infections en réanimation

6 Pourquoi connaître la microbiologie ?
Diagnostic et orientation thérapeutique

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9 Bases microbiologique : la bactérie
Plus de bactéries que de cellules dans l’organisme humains Virus, champignons, parasites, prions

10 %

11 Table 3–4. Known and Estimated Numbers of Biologic Species.1
Group Known Species Estimated Total Species Percentage of Known Species Viruses 5,000 130,000 4% Bacteria 4,760 40,000 12% Fungi 69,000 1,500,000 5% Algae 60,000 67% Protozoa 30,800 100,000 31%

12 Structure des bactéries

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15 La paroi Toutes sauf mycoplasme structure constante la plus externe
Intégrité indispensable a la survie 2 types Paroi épaisse et dense : peptidoglycane ( chaine glucidique reliées entre elles par des peptides) Paroi fine et lâche Peptidoglycane Membrane externe : lipides ( phospholipides et lipopolysaccharide ) (Mb cellulaire) Espace périplasmique (penicillinase)

16 Paroi fine

17 Paroi épaisse

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19 Paroi externe

20 Paroi : implications cliniques
Identification GRAM Antigene LPS Multiplication \ Bactéricidie Efflux Porine

21 Fonction de la membrane
Permeabilité et Transport Diffusion Binding Protein-Dependent Transport Chemiosmotic-Driven Transport Chemotactic Systems Membrane externe bilayered structure; lipopolysaccharide (LPS) antigénémie antigène O Cible des antibiotiques Mort si Mb altérée porine

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23 IDENTIFICATION

24 Coloration de GRAM Distingue les bactéries à parois épaisse et fine
Fixation des bactéries sur lame Coloration violet de gentiane Mordance à la solution de Lugol Lavage à l’alcool Décoloration des parois fines Parois épaisses restent violette Surcolore par de la Fushine

25 GRAM - GRAM +

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28 BGN Klebsiella pneumonia

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30 CG+amas

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32 Les pili Poils Pili communs Pili sexuels Adhésion donc virulence
courts, cassants Adhésion donc virulence Protéines : la piline Antigénémie Déplacement \ mobilité Pili sexuels Relient 2 bactéries Échange de matériel génétique Détermine le sexe

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38 La mobilité Examen direct , état frais Invasivité
Colonisation du materiel (KT,SU…) Certaines bactéries sont très mobiles Leur déplacement est caractéristique ORIENTATION DIAGNOSTIQUE

39 Exemples pyo coli

40 KP

41 Le matériel nucléaire Pas de noyau Chromosome unique, circulaire
Un filament hélicoidal d’ADN bicaténaire 4 bases A-T-G-C Support des information transmises aux ribosomes pour les synthèses Cible des quinolones

42 Les plasmides Eléments circulaires :
matériel génétique extra-chromosomique ADN Autonomes Se réplique indépendamment du chromosome Synthèse protéique Utilisation de substrat Résistance aux antibiotiques Transmissibles à d’autres bactéries (BLSE) Transmission horizontale

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45 la spore Conditions défavorables de survie (bacilles Gram + : Bacillus et Clostridium) formation de spores Sporulation. Conditions favorables bactéries végétatives Germination. La spore contient, sous forme condensée, le génome une partie du cytoplasme déshydraté autour d'une enveloppe très résistante. forme de résistance des bactéries contaminations d'origine tellurique (tétanos, charbon, C difficile).

46 Sporulation Très résistant Manuportéee Aéroportée
Sporicide désinfection Manuportéee Aéroportée Résiste au solutions hydro-alccolique

47 Preservation (conservateur)
Bactériostatique Inhibition de la multiplication bactérienne Bactéricide Mort de la bactérie, dissolution, ne peut plus se reproduire, IRREVERSIBLE Stérilisation Processus physique ou chimique qui détruit complètement toute bactéries vivante SPORES inclues Désinfectants Produits capables de tuer les microorganismes sur des objets ou des surfaces inertes. Les désinfectants sont sporostatiques mais pas obligatoirement sporicides. Septic Caractérise la présence de bactéries vivantes dans les tissus humains. Antiseptic Destruction ou blocage de la multiplication des microorganismes dans des tissus vivants. Aseptic absence de microorganismes pathogènes. Preservation (conservateur) Prévenir la multiplication des microorganismes dans des produits pharmaceutiques ou l’alimentation. .

48 Clostridium Difficile & Diarrheal Disease Pseudomembranous Colitis
Anaérobie, sporulé Spores : sols, hôpitaux… La forme active de la bactérie : intestin Germe G+, la spore G- COMMENSAL Transmission féco-orale 2 toxines A et B Enterotoxine : perméabilté Cytotxine : ç épithéliale Temps transit absorption Diarrhée

49 Infections à anaérobies
La majorité des bactéries de la flore humaine normale sont anaérobies. Leur présence en dehors des sites habituelles (tissus,espaces anatomiques) entraine une infection. Caractéristiques (1) Toujours en continuité avec une muqueuse (2) souvent plurimicrobienne. (3) tendance a former des espaces clos comme des abcès (poumons,cerveau,plèvre,péritoine,pelvis) et a creuser les couches de tissus. (4) Pus est extrèmement malodorant. (5) Sensible à la penicilline sauf Bactéroides et prevotella. (6) favoriser par la baisse du débit sanguin localement , tissu nécrotique, pas de diffusion des ATB. (7) Milieux de transport spéciaux, méthode de culture adaptées. Diagnostic difficile et souvent pas de mise en évidence

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52 PORINE Membrane externe
Permet la diffusion passive des composés hydrophyles de bas poids moléculaire Sucres Acides aminés Ions Pénétration lente des “gros” antibiotiques Modification des porines \ résistance

53 PLP

54 Imperméabilité au Tienam chez Pseudomonas aeruginosa
Efflux

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58 La multiplication bactérienne

59 The Meaning of Growth Table 4–2. Phases of Microbial Growth Curve.
Section of Curve Phase Growth Rate A Lag Zero B Acceleration Increasing C Exponential Constant D Retardation Decreasing E Maximum stationary F Decline Negative (death)

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62 La paroi et la multiplication

63 PLP

64 PLP

65 Sphéroblaste pas de PLPe
bactérie 3 Septalisation PLPs 2 Élongation PLPe Élongation PLPe Filament pas de PLPs Septalisation PLPs Sphéroblaste pas de PLPe

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67 Implication pour le clinicien
“Temps dépendance” ATB bloque la synthèse du peptidoglycane n’agit que si la bactérie qui se multiplie Le taux efficace doit être constant Admisnistration répétées ou perfusion continue “Dose dépendance” Mècanisme de bactéricidie indépendant de la division Synthèse protéique (ribosome, ADN) Bolus , dose élevée

68 Lipopolysaccharides of Gram-Negative Bacteria
LPS, Endotoxine Base de la physiopathologie septique Déclenchement de la réaction inflammatoire Constituant de la paroi externe de tous les BGN Libération lors de la lyse de la bactérie

69 Le LPS : composant essentiel de la membrane externe des BGN
Paroi d’un BGN Alexander , J Endotox Res 2001

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73 Endotoxin Activity Assay Spectral diagnostics
DOSAGE DU LPS Endotoxin Activity Assay Spectral diagnostics

74 Structure du LPS Chaîne O-terminale
Jusqu’à 50 unités oligosaccharidiques répétées, formées de 2 à 8 monosaccharides. Haute variabilité donc spécifiques d’espèce et de de souche. Donne lieu à la classification sérologique des bactéries sauvages. Lipide A Structure relativement conservée entre les espèces. Disaccharide central, 2 groupements phosphate, 6 groupements acyl. Responsable de l’activité endotoxique du LPS.

75 Intérêt d’un dosage du LPS
Nombreux arguments impliquant le LPS dans la physiopathologie du sepsis: LPS est un des plus puissants immunostimulants connus parmi les composants de la paroi bactérienne LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la modification de l’expression de + de 300 gènes LPS in vitro sur des cellules immunitaires induit la production des cytokines impliquées dans la physiopathologie du sepsis LPS iv reproduit la plupart des manifestations observées au cours du sepsis (fièvre, frissons, hyperleucocytose, thrombopénie, coagulopathie,…) Absence de LBP, CD14 ouTLR4 chez l’animal, qui sont impliqués dans la reconnaissance du LPS, les protègent contre un choc septique par des BGN

76 Dosage du LPS par le LAL en clinique
Pathologies non septiques : Cirrhose, transplantation hépatique, hépatite, pancréatite : nombreuses études +, gradient porto-systémique en LPS Choc hémorragique Chirurgie cardiaque ou vasculaire Coureurs de marathon nauséeux …  Translocation à partir du TD Pathologies septiques : LPS + dans 20-40% des cas de sepsis LPS + dans 20-55% des sepsis à BGN qqsoit site LPS + dans 53-79% des bactériémies à BGN Mais LPS également + dans 10-50% des bactériémies à CGP Se = 50-55% , VPP = 40-50% pour bactériémie à BGN (Hurley, J Clin Microbiol 1994, Meta-analyse) Corrélation à l’outcome : OUI dans la méningococcémie ou bactériémies à BGN (OR 6.3) PAS de corrélation sinon

77 Patients à investiguer
Sepsis qq soit germe Etat de choc non septique avec ischémie reperfusion (cardiogénique, hémorragique) : translocation Valider le diagnostic de choc septique Homogénéiser les patients dans les protocoles ! Prix d’un dosage = 25 euros

78 Les délais

79 Examen direct Transport Acheminement Technique < 1 heure

80 Examen macro 5 min

81

82 Etat frais examen direct
PNN, cellules Bactéries, champignons mobilité

83 GRAM

84 KP

85 CG+amas

86 Cg+chaînette

87 amas

88 Bg+clostridium

89 coryne

90 actinomycete

91 aspergillus

92 cholera

93 candida

94 acineto

95 Haemophilus influenzae \ H parainfluenzae
ALA test Haemophilus influenzae \ H parainfluenzae Bacitracin (A) disk group A β-hemolytic streptococci, Bile solubility pneumococci (lysé par la bile) Catalase staphylococci [catalase +], streptococci [catalase -]). Coagulase Staphylococcus aureus C+, S. epidermidis C- Indole Escherichia coli indol + Optochin identification of Streptococcus pneumoniae. Oxidase Enterobacteries : oxidase negative Pseudomonas : oxidase positive PYR hydrolysis Streptococcus pyogenes, Enterococcus sp.,

96 ECBU E. coli 2 heures

97 E. coli 24 heures

98 GRAM antibiogramme

99 ATBgramme 48 heures

100 men

101 men

102 men

103 pyo

104 pyo oxydase

105 ATBgramme pyo

106 pneumo

107 pneum

108 pneu

109 KPhc

110 kp

111 kp

112 staph

113 staph

114 staph

115 listeria

116 Pathogénécité “agent pathogène”
Endotoxine Exotoxine Comment et pourquoi un germe de la flore normale (commensale) devient pathogène ? Les conditions de réanimation Actes invasifs Intervention, inflammation ATB Rupture des barrières Altération de l’équilibre des flores

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118 Habitat habituel des BGN
Tube digestif Peau Pli Muqueuses E. coli normal ± ± + KES normal — — + Citrobacter sp. normal — — + Proteus sp. normal — ± + Salmonella sp. anormal — — — Yersinia sp. anormal — — — Acinetobacter sp. normal ± — ±

119 Ecologie hospitalière des bacilles à Gram négatif (présence possible) (1)
mains peau peau plis muqueuses saine lésée macération saines E. coli — ± ± KES — — ± ± + Proteus sp. ± ± + + + Acinetobacter sp ±

120 Ecologie hospitalière des bacilles à Gram négatif (présence possible) (2)
muqueuse eau dispositifs surface désinfectants lésée médicaux paillasse savon E. coli + ± + ± — KES + + ± ± ++ Proteus sp. + — — ± — Acinetobacter sp. + ± + — ++

121 Colonisation / infection
Seuil > CFU/ g de tissus ou mL De liquide normalement stérile Changement de flore cutanée Vêtements Douche , toilettes … Environnement Faute d’hygiène

122 Identifier la bactérie responsable de l’infection
Symbiose La bactérie s’adapte à son envirronnement incluant les animaux et les humains ou elle réside et subsiste normallement. La bactérie assure sa survie et se reproduit assurant sa descendance. Colonisation micro-organismes “résident” sont en majorité inoffensifs Essentiels pour l’homme photosynthesis, production de vitamines dans l’intestin decomposition de la matière organique. Les vrais “recycleurs” de notre planète Pathogenicité infection accidentelle à partir de bactéries qui infectent les animaux Salmonelle et campylobacter sont transmis par la nourriture. Yersinia pestis, la peste Bacillus anthracis (anthrax) viande crue et poils d’animal infecté. Clostridium species ubiquitaire de l’envirronnement transmis par ingestion ou contact, C perfringens gangrene gazeuse gastroenteritis and C botulinum [botulism]) C tetani

123 Pathogénicité Escherichia coli flore normale ,intestin de l’homme mais aussi le germe responsable d’infections urinaires, diarrhée du touriste et d’autre infections. Pourquoi cette souche est pathogène ?. La virulence de cette souche est retrouvée chez l’animal L’infection est reproductible in vitro Génétiquement cette bactérie possède un marqueur associé au déclenchement de l’infection. pseudomonas species, Stenotrophomonas maltophilia, et la majorité des levures ne provoquent des infections que chez les patients immunodépprimés ou débilités Opportunistes

124 Processus Infectieux : le pneumocoque
Cultivé à partir du nasopharynx de 5 à 40 % des sujets sains Passage dans les poumons Coma Abolition des reflexes… Multiplication dans les alvéoles Pas d’anticorps contre la capsule polysaccharridique de cette souche Passage dans les lymphatiques et le sang Pneumopathie Méningite Endocardite Arthrite….

125 Postulat de Koch L’agent responsable d’une maladie doit répondre au postulat de Koch agent présent chez tous les individus présentant la pathologie Agent pouvant être cultivé Agent qui lorsqu’il est introduit chez l’hôte ou dans un modèle s’en rapprochant induit le développement de la pathologie Possibilité de réisoler l’agent à partir d’un animal présentant la pathologie

126 Exotoxines Produites par les G+ et les G- C. diphtheria
Muqueuses ORL et plaies cutanés Bactériophage diphtérie C tetani, C botulinum Sol , eau, multiplication si anaérobiose Toxine absorbé par l’intestin Membrane pré synaptique des motoneurones des nerfs périphériques et nerfs crâniens Inhibe la libération de l’acetylcholine paralysie

127 Exotoxines C perfringens S aureus Streptocoque β hémolytique A
Alpha toxin , lécithinase, collagénase, DNAse Destruction des membranes S aureus TSST 1, toxic shock syndrom Streptocoque β hémolytique A Pyrogenic exotoxin A Super antigène scarlatine

128 Exotoxines associées aux diarhée et aux intoxications alimentaires
V cholerae pénétration par voie digestive Se fixe aux microvillosités 2 sérotypes : O1 et O139 Production de la toxine S aureus enterotoxines déja présentes dans l’alimentation 6 types d’enterotoxine de staphylocoque Y enterocolitica Vibrio parahaemolyticus Aeromonas species, C perfringens

129 Activité antimicrobienne in vitro
Antibiogramme Dosage des antibiotiques (sang, tissus)

130 Définition de la résistance CA - SFM
Sensible (S) : probabilité acceptable de succès thérapeutique si traitement par voie générale à dose habituelle (CMI<<<C° sérique Résistant (R) : forte probabilité d’échec thérapeutique quel que soit le type de traitement (CMI >>> C° sérique) Intermédiaire (I) : succès imprévisible (CMI proche C° sérique)

131 Résistance naturelle Caractéristique propre à une espèce bactérienne
Partagée par toutes les souches normales de cette espèce Définit le phénotype sauvage ou sensible de cette espèce Référence pour établir le spectre d’activité des ATB (espèces habituellement sensible)

132 Résistance acquise Caractéristique de certaines souches au sein d’une espèce bactérienne Résulte d’une modification génétique Mutation Acquisition de matériel génétique étranger Définit des phénotypes résistants Fréquence prise en compte dans la nouvelle nomenclature du CA-SFM (espèces inconstamment sensibles)

133 Comité de l’antibiogramme
Antibiogramme : méthodes, doses … Données pharmacocinétiques Diamètre en fonction Milieu de culture Conditions de culture Disque et C° espèce

134 Supports de la résistance
Chromosomique Stable Transmission verticale (descendance) Épidémie de souches Plasmidique Instable(cure si pas de pression de sélection) Transmission verticale Transmission horizontale Épidémie de souches ou du support lui-même

135 La résitance bactérienne pour les cliniciens
Il suffit de le savoir !!!!!!!!! Orientation diagnostique Terrain Infections hospitalières Antibiothérapie préalable L’antibiothérapie initiale doit tenir compte d’une potentielle résistance bactèrienne Adapter au bout de 48 heures

136

137 Acquisition de résistance
mutants résistants Mutant : augmentation de la CMI Apparition d’un mécanisme de résistance Modification de la séquence nucléotidique du gène responsable La sélection Mutant présent dans la population sensible L’antibiotique permet la sélection de ces mutants

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139 Facteurs favorisant la sélection
La bactérie Nombre d’étape mutationnelle Proportion élevée de mutants Bas niveau de résistance naturelle ou acquise L’antibiotique Concentration locale comprise entre CMI/S et CMI / R Bactéricidie sur les bactéries sensibles Foyer infectieux Inoculum bactérien important Site Corps étranger

140 Prévention de la sélection
Identifier les situations « à risque »(bactérie,ATB,foyer) Diminuer l’inoculum bactérien Drainage Premier antibiotique peu sélectionnant (oxacilline ou glycopeptide sur SA Posologie élevée Association d’antibiotiques

141 Activité antimicrobienne in vivo
Diffusion, distribution, métabolisme, et toxicité Relations drogue-pathogène Diffusion au site de l’infection Intra-cellulaire Quinolones, tetracyvlines Aminosides Anaérobie, tissus nécrotique, ischémie Aminosides, quinolones liposolubilité chloramphenicol, rifampin, trimethoprim, isoniazid imidazole Inoculum. pH du milieu Pus et tissus nécrotiques Aminosides polymixines hémoglobine. Penicillins and tetracyclines

142 Le choix du “bon” antibiotique
Identification de l’agent infectant GRAM, examen direct, PNN, … Antigene, latex, PCR bacteriologic statistics and epidemiology antibiogramme Facteurs liés à l’hôte allergie Age acidité gastrique reduit l’absorption des peni, absorption du ketoconazole diminuée par les antiacides tetracyclines . Fixation sur l’émail dentaire quinolone . Toxique pour les cartilages et ligaments Anomalies Genetiques ou Metabolique (ISONIAZIDE acetyleur) grossesse Renal and Hepatic Function Corps étranger glycocalyx or biofilm,

143 glycocalyx

144 Mécanisme de bactéricidie
Paroi bactérienne Beta lactamines, glycopeptides Membrane cytoplasmique Polymyxines Synthèse protéique Aminosides, cyclines, macrolides, lincosamides, streptogramines, rifampicine, chloramphenicol, acide fusidique, triméthoprime-sulfaméthoxazole Réplication de l’ADN Fluoroquinolones Inhibiteurs de beta-lactamases

145

146 OGM

147

148 Le microbe n'est rien. Le terrain est tout. »

149 Conclusion Apport majeur de l’examen direct
Identification rapide et traitement adapté Confirmer le choc septique Essayer de limiter la diffusion de la résistance bactérienne Controle de l’antibiothérapie

150 Merci de votre attention….

151 Et lavez vous bien les mains…