Principales techniques et applications

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1 Principales techniques et applications
Vitrotechniques Principales techniques et applications

2 Micropropagation

3 Micropropagation Apex de tige ou bourgeons latéraux,
Procédure en trois étapes (Murashige, 1974) I : établissement du tissu en conditions d’asepsie II : multiplication de tiges feuillées III: formation de racines et conditionnement de propagules avant transfert en serres Clonage très fidèle et très efficace rosiers à partir d’un bourgeon

4 Multiplication par bourgeons axillaires
Micropropagation Multiplication par bourgeons axillaires Acta agriculturae slovenica, , november 2004 Multiplication par bourgeons adventifs Problèmes : vitrification (hyperhydricité liée à la production d’éthylène)

5 Applications Horticulture, Sylviculture, Agronomie
Micropropagation Applications 32 millions de plants en 2004 en Allemagne Horticulture, Sylviculture, Agronomie Les « grands succès » économiques Banane Orchidées Pomme de Terre Rhododendron Fraisier Conservation de la biodiversité plantes carnivores

6 Winkelmann et al. 2006 Plant Cell Tiss Organ Cult

7 L’industrie de la micropropagation
Gain de place Affranchissement des saisons Rapidité Qualité sanitaire et homogénéité Pour certaines espèces : pas d’autres solutions

8 Exemples de PME réalisant de la micropropagation
Vivai Battisitini (Italie) 20 hottes à flux laminaire 60 000m2 de serres 3 chambres de culture plants vendus chaque année Multiplication Assainissement Création variétale Technivit (Bourges)

9 Micropropagation Bioplant (Belgique) En 2004 en Allemagne : 8 des 32 entreprises font 92 % de la production, avec pour chacune > plants /an Lecture conseillée : Traud Winkelmann et al. Commercial in vitro plant production in Germany in 1985–2004. Plant Cell Tiss Organ Cult (2006) 86:319–327

10 Assainissement de lignées
Culture de méristèmes Assainissement de lignées

11 Obtention de lignées saines
Principe : les méristèmes sont indemnes de virus (travaux de P. Limasset) Culture de méristèmes Quelques 1/10 mm Régénération de plantes saines Attention : les lignées sont toujours sensibles à des infections ultérieures !!!

12 Applications Espèces à reproduction végétative
pomme de terre, bananier, artichaut, fraisier… Normes sanitaires internationales Premiers succès dans les années 50 Service proposé par la plupart des sociétés de biotechnologies végétales

13 Embryogenèse somatique

14 Embryogenèse somatique
Génération d’un embryon à partir d’un méristème, d’un cal ou de suspensions

15

16 Embryogenèse somatique
Pour mémoire : l’embryogenèse zygotique Source :

17 Masses de cal renfermant des cellules initiales d’embryons somatiques
Exemple : la luzerne Explants = Pétioles Embryogenèse somatique Mise en culture 2,4-D + kinétine 25°C 3 semaines, photopériode 16h, 75 µE Masses de cal renfermant des cellules initiales d’embryons somatiques Dispersion en milieu liquide B5 (2,4-D + kinétine) 7 jours Tamisage : fraction mm transférée sur milieu solide Développement des embryons : 5-7 jours

18 Premier milieu de maturation (sucrose)
Embryogenèse somatique Premier milieu de maturation (sucrose) Second milieu de maturation (ABA, 3 jours) Rinçage, deshydratation (15% H2O) Conservation : 1 an Source : Crop Science, University of Guelph

19 Vers l’identification de régulateurs de l’embryogénèse somatique …
Pour le critère d’embryogénèse somatique spontanée, par screening sur une population de plantes dont la mutation ‘gain de fonction’ est inductible par un traitement chimique , identification du gène WUSCHEL

20 Comprendre la nature des cellules souches
Notion de cellule souche en biologie végétale Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

21 Les gènes WUSCHEL et CLAVATA au coeur du processus d’embryogénèse somatique

22 Les gènes WUSCHEL et CLAVATA au coeur du processus d’embryogénèse somatique

23 Embryogenèse somatique
Applications Obtention de semences pour des variétés stériles (ex: pommes de terre polyploïdes, bananier…) Semences « d’élite » pour des espèces allogames Solution pour la conservation d’espèces tropicales dont les semences sont dites « récalcitrantes » à la déshydratation Obtention rapide de semences « d’élite » pour des espèces ligneuses Possibilité de cultures en réacteurs : production de semences artificielles à grande échelle (gymnospermes)

24 Dans le cadre d’Agrotransformations
Embryogenèse somatique Dans le cadre d’Agrotransformations Plant Cell Rep (2009) 28:1385–

25 Semences artificielles (synseeds)
Embryogenèse somatique Semences artificielles (synseeds)

26 Embryogenèse somatique
Feijoa sellowiana

27 Non-conformité de la multiplication
Vitrovariation Non-conformité de la multiplication

28 La vitrovariation Les plantes régénérées à partir de cals, de protoplastes ou de feuilles ne sont pas toujours des clones parfaits: instabilité chromosomique, aneupleuïdies différences morphologiques

29 Clone V Clone C Clone A Clone B diploide Clone B chimère trisomique
Clone C diploïde Clone C trisomique J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169

30 J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169

31 Utilisation de la vitrovariation
Mise à profit de la variation somaclonale dans le cadre de programmes de sélection Sélection de cals tolérants à des stress Augmentation artificielle de la variabilité Traitements chimiques Radiations Base de données sur les variétés issues de « mutation breeding »  42 variétés en France

32 Création de variabilité
Mutagenèse et « mutation breeding »

33 Phénotypes travaillés
type compact couleur des fruits autofertilité  absence de graines précocité, date de maturité des fruits résistance aux maladies  :

34 Exemples à l’INRA d’Angers
UMR Génétique et Horticulture INRA/INH/Université d’Angers Equipe : Méthodologie de la sélection et innovation variétale (A. Cadic) Arbres ornementaux : GIE Saphinov Pommier : SARL Novadi

35 Amélioration d’une plante ornementale : le Caryopteris
Le SAPHINOV est un GIE de pépiniéristes impliqué dans des collaborations avec l’INRA d’Angers concernant la séléction variétale Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Heavenly Blue Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Grand Bleu® Peu de variabilité dans les populations Micropropagation et mutagenèse par irradiation

36 1er prix New Plants 99 - Paris
Vitropropagation (mise au point) 1er prix New Plants 99 - Paris INRA/SAPHINOV. Diffusion SAPHO Irradiation de bourgeons : rayons γ (60Co) (trouver la dose adéquate) Acclimatation, obtention de graines Régénération des plantules Semis et sélection sur la nouvelle génération Sélection des mutants Acclimatation, croissance Stabilité des caractères Perte des caractères (????) Commercialisation

37 1972 Micropropagation et mutagenèse par irradiation
© INRA, A. Cadic 'Courtalyn' WEEK-END ® Forsythia variété 'Lynwood'. Hybridation classique © INRA, A. Cadic © INRA, A. Cadic 'Courtacour' BOUCLE D'OR 'Courtasol' MAREE D'OR ®

38 Apport des biotechnologies dans l’amélioration du Bananier
Variétés polyploïdes, stériles, fortement hétérozygotes Multiplication végétative L’amélioration génétique par croisement est impossible Presque toutes les variétés de bananes et de plantain découlent de mutations spontanées

39 Mutagenèse par irradiation de vitroplants de bananiers
Sélection de mutants de petite taille, à fructification précoce Possibilité de 4 récoltes tous les 2 ans (au lieu de 3) PROF. KSHANIKA SANNASGALA HIRIMBUREGAMA Colombo, Sri Lanka Source FAO

40 Problème de l’irradiation de tissus méristématiques : obtentions de chimères
Solution (chez le bananier): Embryogénèse à partir de suspensions cellulaires Démonstration que les embryons somatiques sont issus de cellules uniques Irradiation de suspensions de cellules embryogéniques γ γ

41 Quand même…on peut espérer des caractères ‘positifs’
Application d’une toxine qui joue le rôle d’effecteur pour un pathogène Sélection de lignées de cals résistants à la toxine Sengor et al. Plant Growth Regul (2009) 58:201–209

42 Quand même…on peut espérer des caractères ‘positifs’
Régénération et observation des caractères de résistance sur les plantes cultivées au champ Sengor et al. Plant Growth Regul (2009) 58:201–209

43 Sauvetage d’embryon

44 Incompatibilité du porte graine
Sauvetage d’embryons Incompatibilité du porte graine Les semences hybrides sont viables mais le développement ne peut se faire sur le pied mère Régénération de la plante par culture in vitro de l’embryon Exemple de la triticale (Triticum x Secale)

45 Préparation, applications
Protoplastes Préparation, applications

46 Protoplastes Protoplastes Définition : cellule de plante, de bactérie ou de champignon débarrassée de sa paroi

47 Isolement de protoplastes
Vieille école : Rupture mécanique des parois Milieu isotonique Milieu hyperosmotique Faible rendement

48 Isolement de protoplastes
Milieu isotonique Milieu hyperosmotique Digestion enzymatique: Cellulase Pectinase Paroi primaire : 20-30% cellulose 70-80 % hémicellulose et pectine

49 Purification de protoplastes
vivants morts, déchets Filtration Tamis successifs 100 à 30 µm Rinçages Flottement sur coussin de saccharose Saccharose 20%, 100g Contrôles Mortalité : Bleu Evans Viabilité : Florescein Diacetate (FDA) Théoriquement > 80 % viabilité

50 Culture de protoplastes
Couche mince, milieu liquide Composition des milieux Milieux MS (Murshige et Skoog), B5 (Gamborg)… Maintenir un potentiel osmotique bas Glucose 0,35 M Glucose + mannitol Doses élevées d’hormones Deux auxine fortes (2,4-D + ANA) + cytokinine Premiers temps à l’obscurité : éviter l’oxydation

51 Intérêt des protoplastes
Transformation génétique Régénération de plantes à partir de cultures de protoplastes Etudes d’échanges de métabolites Fusion de protoplastes

52 Fusion de protoplastes
Fusion spontanée (soja, maïs) Ca2+ pH basique PEG Choc électrique

53 Comment trier les hybrides ?
Protoplastes Comment trier les hybrides ? Exemple : fusion entre un protoplaste de poireau et un protoplaste de choux rouge Thlaspi + tiges étiolées de B. napus cultivé à l’obscurité Theor Appl Genet (1999) 99:761–771 Mais aussi : résistance à des xénobiotiques, auxotrophie tri sur des caractères morphologiques

54 Comment se répartit le matériel génétique ?
Protoplastes Comment se répartit le matériel génétique ? noyaux mitochondries chloroplastes hybrides somatiques (addition des noyaux) Cybrides (cytoplasmes hybrides)

55 Application agronomique
Protoplastes Application agronomique Collonier et al Plant Science Solanum melongena Ralstonia solanacearum Verticillium dahliae sensibilité Bonne tolérance Solanum sysimbrifolium Problème: fécondation croisée inefficace

56 Mélanger les deux préparations dans une boite de Petri
Protoplastes Collonier et al Plant Science Confection de protoplastes à partir de 500 mg de feuilles de chaque espèce Ajustement de la densité à / ml dans 0.5M mannitol + 0.5mM CaCl2 Mélanger les deux préparations dans une boite de Petri Alignement : courant alternatif 15s, 230, V.cm-1, 1 MHz Fusion : courant continu 2*45s 1200 V.cm-1

57 Après le choc électrique : milieu de culture + 0.4 M de glucose
Protoplastes Collonier et al Plant Science Après le choc électrique : milieu de culture + 0.4 M de glucose + PEG 250 mg/l + hormones : 2,4-D, zeatin, NAA Milieu neuf : 2,4-D + BAP 7 jours à l’obscurité 15 jours à la lumière Milieu de multiplication sans hormones Milieu de régénération de tiges : zéatine et IAA Sélection des hybrides (400) cal 22 plants régénérés

58 Comment être sûr qu’il s’agit d’hybrides ?
Protoplastes Comment être sûr qu’il s’agit d’hybrides ?

59 Détermination de la ploïdie par cytométrie en flux
Protoplastes Collonier et al Plant Science Détermination de la ploïdie par cytométrie en flux 4 hybrides

60 Morphologie des hybrides
Protoplastes Collonier et al Plant Science Morphologie des hybrides

61 Dénombrement des chromosomes respectifs
Protoplastes Collonier et al Plant Science Dénombrement des chromosomes respectifs GISH : Genomic In Situ Hybridization sonde : ADN de S. sysimbrifolium « coloré » à la fluoresceine Contre coloration : iodure de propidium 24 chromosomes de chaque

62 Origine des gDNA et cpDNA
Protoplastes Origine des gDNA et cpDNA Collonier et al Plant Science RAPD pattern (Random Amplification of Polymorphic DNA) Les ADN génomiques sont tous les deux présents Random Amplified Polymorphism of DNA Cleaved Amplified Polymorphic Sequence CAPS pattern (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) Les chloroplastes sont de S sysimbrifolium !!

63 Tolérance au flétrissement bactérien causé par Ralstonia
Protoplastes Collonier et al Plant Science Tolérance au flétrissement bactérien causé par Ralstonia S. melongena S. sysimbrifolia Hybride Collonier et al Plant Science

64 Un autre exemple pour la phytoremédiation du zinc
Brewer et al. Theor Appl Genet (1999) 99:761–771

65 Brewer et al. Theor Appl Genet (1999) 99:761–771

66 Haplo/diploïdisation
Androgenèse, Gynogenèse

67 Des haploïdes : pourquoi faire ?
Haplo/diploïdisation Des haploïdes : pourquoi faire ? Recherche de mutations récessives Haplo/diploïdisation : homozygotie 100% Des homozygotes : pourquoi faire ? Outil de sélection : espèces autogames  variétés lignées pures espèces allogames  obtention de parents d’hybrides Descendances en ségrégation pour analyses QTL

68 Obtention de plants haploïdes
Haplo/diploïdisation Obtention de plants haploïdes In vivo Apparitions spontanées (rares) Méthodes particulières de pollinisation pollen irradié pollinisation croisée entre génotypes incompatibles In vitro Culture de gamétophytes immatures

69 Haplo/diploïdisation
Androgenèse Limite : albinisme dans certains cas Développement sporophytique (haploïde) par culture des gamétophytes mâles Cultures d’anthères ou de microspores isolées

70 Haplo/diploïdisation
Gynogenèse Développement sporophytique de gamétophytes femelles  obtention de plants haploïdes Culture in vitro d’ovaires ou d’ovules Pollinisation croisée Utilisation de pollen irradié Parthénogenèse in situ

71 Doublement des chromosomes
Haplo/diploïdisation Doublement des chromosomes Spontané (parfois) Utilisation d’agents mitoclasiques Blocage de la polymérisation des microtubules Colchicine Oryzaline Contrôle de la ploïdie Cytométrie en flux

72 Obtention d’haploïdes de pommier
Haplo/diploïdisation Source : Obtention d’haploïdes de pommier Le pommier : un matériel génétique difficile à étudier: Cycle reproductif lent (période juvénile 5-7 ans) Autostérilité Impossible d’obtenir des lignées 100% homozygotes par la sélection classique Obtention de lignées haploïdes Doublement chromosomique

73 Obtention des haploïdes
Haplo/diploïdisation Source : Obtention des haploïdes Fécondation avec du pollen irradié à 200 Gy Récolte des graines et semis Première étape : sélection des haploïdes

74 Micropropagation des haploïdes
Haplo/diploïdisation Source : Micropropagation des haploïdes Mise en culture d’apex Multiplication (repiquage toutes les 5 semaines)

75 Doublement de chromosomes
Haplo/diploïdisation Source : Doublement de chromosomes Recouvrir avec du milieu contenant de l’oryzaline µM Incuber 2 heures à 2°C Cultiver 1 mois

76 Haplo/diploïdisation
Source : Contrôle de la ploïdie Comptage des chromosomes Cytométrie en flux

77 Microgreffage et sortie d’in vitro
Haplo/diploïdisation Source : Microgreffage et sortie d’in vitro humidité relative 80%

78 Autres utilisation du doublement de chromosomes
Obtention de lignées tétraploïdes Robustesse Stérilité  exemple du schéma de production de graines de pastèques triploïdes Pollinisateur 2N F0 2N ♂ ♂ Fruits sans pépins F1 3N ♀ colchicine ♀ F-1 2N F0 4N

79 Cryoconservation

80 Définitions Conservation de matériel vivant à très basse température
Cryoconservation Définitions Conservation de matériel vivant à très basse température Azote liquide (-196°C) Vapeurs d’azote (-150°C) Etat de vie suspendue, réversible

81 Conservation d’espèces en voie de disparition :
Problématique : Conservation d’espèces en voie de disparition : objectif agronomique : réservoir de variabilité utilisable pour des plans de sélection objectif médical : réservoir de substances actives inconnues objectif éthique : préservation d’une richesse de nature non-marchande Conservation de variétés agronomiques ou horticoles intéressantes Eviter de perdre les variétés tombées en désuétude Erosion génétique des espèces à multiplication végétative Conservation de graines orthodoxes à basse température : Le Kew Garden à Londres Graines récalcitrantes Espèces à multiplication végétative (pomme de terre, bananier, manioc) Souches de culture in vitro

82 Exmple : Conservation de cultures de bananes
Cryoconservation Cultures in vitro en conditions de croissance réduite : Avantage : faible surface / jardin botanique Inconvénients : importantes charges de travail risque de pertes : contaminations, erreur humaine variations somaclonales Exmple : Conservation de cultures de bananes

83 Meilleure solution : la cryopreservation
Cryoconservation Meilleure solution : la cryopreservation stockage à –196°C cryopreservation de cultures de tissus (100 espèces) cyopreservation de graines récalcitrantes (40 espèces) conservation de souches de cellules fortement productrices de métabolites secondaires conservation de tissus génétiquement modifiés

84 Cryoconservation Principes Éviter la formation de cristaux dans le cytoplasme  favoriser la vitrification = solidification non-cristalline Congélation rapide Déshydratation des échantillons Séchage à l’air (sous flux, atmosphère faible hygrométrie) Déshydratation par prérefroidissement Accumulation d’osmoprotectants Déshydratation, froid Acide abscissique Ajouts de composés osmoprotecteurs

85 Déshydratation par congélation
Cryoconservation Déshydratation par congélation Refroidissement progressif  coûteux Prérefroidissement (-40°C) H2O Abaissement du potentiel hydrique du milieu extracellulaire H2O Formation de cristaux dans le milieu extracellulaire Le cytoplasme reste en surfusion H2O Déshydratation de l’échantillon

86 Substances cryoprotectrices
Cryoconservation Substances cryoprotectrices DMSO, glycérol, proline Adaptation métabolique: Froid Modulation photopériode ABA [solutés ] Sucres, proline, glycine bétaïne

87 Définitions germoplasme : Entité biologique dotée d’une composition génétique distincte Accession : Germoplasme identifié comme appartenant à une collection (GeneBank)