Ecole Doctorale de Cancérologie

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1 Ecole Doctorale de Cancérologie
Master 2 de Physique Médicale PARIS XI ( ) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables: J.M. COSSET-J. BOURHIS RB1.9 Lésions radio-induites de l’ADN: Mécanismes de réparation Inhibiteurs de la réparation Dr. Dietrich Averbeck Institut Curie-Section de Recherche Laboratoire Raymo,nd Latarjet Bâtiment 110 Centre Universitaire d’Orsay F ORSAY Cedex Tél ;FAX: Cours le Jeudi 2 Novembre h00 à 12h30 Faculté Kremlin Bicêtre,63 rue Gabriel Péri,94276 Kremlin Bicêtre, Salle Pinel

2 Radiobiologie Rayonnements Ionisants Ultraviolets Matière vivante
Conséquences Biologiques Environnementales Sanitaires Approches expérimentales et conceptuelles Physique (rayonnements, dosimétrie); Chimie (chimie radicalaire); Biologie: (moléculaire, cellulaire, enzymologie, génotoxicologie, génétique, cancérologie) Médecine (radiothérapie, radiopathologie, radioprotection)

3 Radiobiologie La radiobiologie vise à mieux comprendre l ’interaction de l ’irradiation avec la matière vivante et les conséquences biologiques à court et long termes (létalité, altérations génétiques, cancer...) Une meilleure connaissance dans ce domaine permet - une définition de la radiosensibilité des cellules normales et tumorales, des tissus et des individus. -une meilleure radioprotection -une meilleure adaptation des doses de radiodiagnostic et de radiothérapie

4 Expositions aux radiations
Régions d’une radioactivité naturelle élevée 50 à 100 mSv/an (Kerala (Indes), Brésil) Radioactivité naturelle (France) 2,4 mSv/an Montagne à 1500 m d ’altitude 3,6 mSv/an Scanner mSv /an Domaine médicale mSv/an Vol Concorde Paris/New York 0,06 mSv per trajet Centrales nucléaires en France 0,002mSv/an Pollution par les essais aériens des années 60 0,005mSv/an (2001) Pollution après Tchernobyl en Europe de l ’ouest 0,002 mSv/an(2001)

5 Une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets
des radiations ionisantes peut aider à: 1. Trouver des agents chimiques qui modifient la réponse -- radioprotection des cellules normales -- radiosensibilisation des cellules tumorales 2. Définir la radiosensibilité intrinsèque des tumeurs -- pronostic -- protocole thérapeutique « individualisé » 3. Définir la radiosensibilité des individus -- exposition environnementale et protection -- détection d ’hétérozygotes pour des gènes de radiosensibilité (ataxie telangiectasie..)

6 Identification de l ’ADN comme cible importante
de l‘ irradiation ionisante - 60 désintégrations d ’I125 par noyau donnent 50% de survivants (iododéoxyuridine: analogue de base incorporé dans l ’ADN des chromosomes) désintégrations d ’I125 à la surface membranaire donnent 50% de survivants (concanavaline A iodinée) On a déduit que l ’ADN est la cible la plus importante des désintégrations radioactives

7 Le corps humain est constitué de milliards de cellules
(en grande partie régulièrement renouvelées) Tissus cellulaires Noyau avec le matériel génétique (ADN) mitochondrie ADN en double hélice Cellule: unité de fonctions

8 L’ADN est le vecteur de l’information génétique:
La séquence des nucléotides dans l’ADN ordonne (ou code) la séquence des acides aminés dans les protéines - L’ADN sert de matrice pour sa propre réplication - Toutes les molécules d’ARN sont produites sur les matrices ADN - Toutes les séquences protéiques sont déterminées par les matrices d’ARN duplication ADN transcription ARN traduction Protéine

9 Structure de l’ADN, vecteur de l’hérédité
Les unités fonctionnelles de l’ADN, les gènes, sont définies par les séquences des bases (T-A-G-C) sur les deux brins complémentaires. 5’ G C T A ponts phosphodiester T A C G désoxyribose (sucre) 2 nm 3’ sucre bases puriniques bases pyrimidiques phosphate G A T C Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

10 Appariement de bases dans l ’ADN

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12 ADN chromosome

13 Spectre des ondes électromagnétiques
Radiations ionisantes Radiations solaires Rayons cosmiques Rayons Gamma Rayons X Radiations UV Lumière Visible Radiations Infrarouge Ondes Radio UVC UVB UVA 100 280 320 400 longueurs d’onde (en nanomètres) Radiations ultraviolettes terrestres Radiations absorbées par l’ozone (D ’après SAGE, CNRS / Curie 1997)

14 Carcinogenèse: processus multi-étape
Agents génotoxiques, UV, RI, virus etc. Tumeur Métastases Initiation Promotion Progression Cancer Dommages de l’ADN Mutations Instabilité génétique Sélection clonale Cellules malignes Réparation de l’ADN Induction de gènes Transduction des signaux

15 Dommages endogènes de l’ADN
(selon E. Mullaart et al. Mutat. Res. 237, (1991)) Source Type de dommage Taux de lésions induites endogène par cellule et par jour Température (37°) Cassures simple brin Sites AP Démination de la cytosine Radicaux libres Dommages de bases (total) 10000 Metabolisme Dommages des sucres/bases Pontages ADN-protéine ? Pontages ADN/ADN ? Cassures simple et double brin ?

16 Dommages exogènes induits par des agents génotoxiques

17 Endogenous and exogenous DNA damage
(adapted from E. Mullaart et al. Mutat. Res. 237, (1991)) Source Type of DNA damage Estimated number of lesions Endogenous induced per cell and per day body temperature single strand breaks AP sites Deamination Free radicals Base damage Metabolism Sugar, base damage, DNA- protein CL Exogenous Sun-bathing (1h) Thymine dimers Smoking (20 cigarettes/day) DNA adducts of PAH Coal power station BPDE Natural radiation single strand breaks 2 per year background ( mSv/year) D. Averbeck, Inst. Curie, UMR2027 CNRS, Orsay

18 Lésions endogènes dans l’ADN
Desamination de la cytosine Oxydation de la guanine

19 Réponse aux agents génotoxiques (radiations etc.)
Dommage de base Cassure simple brin Cassure double brin et lésions complexes Signalisation Induction de gènes Arrêt du cycle cellulaire Réparation Mort cellulaire incorrecte correcte Mutation Survie Instabilité génétique Transformation cellulaire Carcinogenèse

20 Dommages radio-induits dans l’ADN
Cassure simple brin (CSB) protéine Pontage intrabrin Pontage ADN-protéine Modification d’une base (oxydation, réarrangement, adduits) Site abasique (apyrimidique ou apurique) Cassure double brin (CDB) Lésions complexes et groupées, Dommages multiples localisés (LMDS)

21 Dommages oxydatifs de l ’ADN
H N O C 3 Thymine glycol 5,6-dihydro- thymine Uracile glycol 2 5-hydroxy-5-méthyl- hydantoine Urée acide b -ureidoisobutyrique 5-hydroxycytosine 5-hydroxyuracile 5,6-dihydroxy- cytosine 5,6-dihydroxyuracile 5-formyluracile 5-hydroxyméthyl- uracile 8-oxoguanine 2,6-diamino-4-hydroxy- 5-formamidopyrimidine 8-oxoadénine 2-hydroxyadénine 4,6-diamino-

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23 Irradiation : 8 Gy 8 Gy + Fpg
Test de comètes Noyaux de lymphocytes avant et après irradiation  Lymphocytes inclus dans 1% agarose Sans traitement Fpg lame de verre Lymphocyte Lyse (Triton X-100 2.5 M NaCl, pH10) Noyau Bases oxydées clivées par Fpg et Nth Séparation des brins d’ADN (300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA) -Electrophorèse (0,6 V/cm, 1h ) -Neutralisation, coloration avec DAPI -Analyse sous microscope de fluorescence Irradiation : 8 Gy Gy + Fpg Les fragments de l’ADN forment la queue de la comète, dépendant du nombre de cassures et de dommages oxydatifs radioinduits.

24 Test de « comètes » Fragmentation du matériel génétique (ADN)
dans les noyaux de cellules humaines après un stress génotoxique Cellules non endommagées Cellules traitées par des rayons

25 Niveau de dommages oxydatifs (8-oxoG) dans le sang humain (lymphocytes)
1,2 1 0,8 Hommes 0,6 Femmes 0,4 0,2 France Ireland Espagne Pays-Bas Angleterre (D ’aprèsA.R. Collins, BioEssays 1999; 21: )

26 Induction de dommages oxydatifs (cassures) dans l ’ADN de lymphocytes humains et protection
Superoxyde d ’hydrogène (A.R. Collins, BioEssays 1999; 21: )

27 Les lésions radio-induites dans l’ADN
Radiation ionisante O H OH° 02- eaq- Effets directs (30-40%) par excitation/ionisation Effets indirects (60-70%) par les radicaux libres de radiolyse de l’eau CDB/LMDS CSB Pontages ADN/protéine Bases modifiées (oxydées) Sites abasiques (AP) Pontages ADN/ADN Adduits (Chapman et al. Radiat. Res. 56, ,1973; Roots R., Okada S. J Biol Chem. 278, ,1975)

28 Dommages multiples localisés (LMDS)
Dépôt d ’énergie par les électrons en fin de parcours ADN Rayons X , g Dommages oxydatifs Cassure simple brin Cassure double brin t Goodhead DT, IJRB 1994; 65: 7-17 Ward JF, IJRB 1994: 66: Les dommages multiples localisés (LMDS) sont définies comme deux ou plusieurs lésions formées dans l’ADN au niveau d’un ou deux tours de la double hélice à la fin du parcours des électrons radioinduits

29 Détection de CDB et de LMDS radioinduits dans les cellules de mammifère
Les CDB sont détectées par électrophorèse en champ pulsé (ECP) séparation de fragments d’ADN jusqu’à environ 8 Mégabases Les dommages complexes ou LMDS contiennent plusieurs dommages oxydatifs et CSB très proches sur les brins d’ADN opposés. On connaît des N-glycosylases comme Fpg, Nth ou Nfo capables d’introduire une coupure aux sites oxydatifs. Les LMDS peuvent ainsi être transformés en cassures double brin additionnelles détectables par ECP. Utilisant cette approche, plusieurs auteurs ont trouvé un nombre considérable de LMDS (3 à 4 fois plus que de CDB!) après irradiation à haut et même à faible TEL (Sutherland B et al. ,PNAS 2000; 97(1): ). Après surexpression des N-glycosylases hNTH et hOGG1 dans les cellules de mammifère, les effets cytotoxiques de l’irradiation ionisante augmentent, ce qui est en accord avec l’induction de LMDS in vivo et leur transformabilité possible par les N-glycosylases en CDB létales (Yang et al.,DNA Repair.2006;5(1): ).

30 Les effets létaux radio-induits sur les lymphoblastes TK humains augmentent quand l’activité des ADN glycosylases est augmentée (Yang N et al. DNA Repair 5,2006;43-51) Apparemment, l’incision des LMDS par les glycosylases augmente la létalité radioinduite. Par contre, l’inhibition de l’activité hOGG1 diminue la létalité.

31 dans les cellules humaines irradiées
La détection des LMDS dans les cellules humaines irradiées Contrairement aux données de la littérature, en utilisant une méthodologie limitant les oxydations artefactuelles lors de la lyse cellulaire, nous avons mis en évidence relativement peu de ce type de lésions dans les cellules de mammifère après irradiation à faible et haut TEL. LMDS artefactuelles Véritables LMDS ---> Les lésions groupées (LMDS) prédites consistent probablement majoritairement en CDB complexes avec des terminaisons oxydées; ces lésions complexes et hautement réfractaires à une réparation sont probablement plus létales que mutagènes.

32 Technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP)
Coloration Cellules Moule à blocs Lyse de membranes cellulaires Traitement enzymatique éventuel (Fpg / Nth) Inclusion des blocs dans un gel d’agarose Cellules incluses dans l’agarose Électrophorèse

33 Schéma d ’une analyse Irradiation des cellules
(incubation post-radique à 37°C possible pour l ’étude de la réparation des dommages) Inclusion des cellules dans des blocs d ’agarose Préparation des blocs d ’agarose Irradiation des blocs d ’agarose Traitement des blocs d ’agarose (lyse des membranes cellulaires et éventuellement, traitement avec une glycosylase ou endonucléase) Inclusion des blocs d ’agarose dans le gel d ’électrophorèse Électrophorèse Coloration du gel (BET) Analyse d ’image et quantification Calculs de la FAR, la taille moyenne des fragments, la fréquence des CDB Dose (Gy) FAR (%)

34 Electrophorèse en champ pulsé
HD FD Chr. 10 20 30 40 Gy 10 20 30 40 Gy Chr.

35 Cassures double brin sont radioinduites linéairement avec la dose
(Résultats obtenus par électrophorèse en champ pulsé) R 2 = 0,9727 10 20 30 40 50 60 Dose (Gy) FAR (%) HD

36 (Aten JA Science. 2004 Jan 2;303(5654):92-5)
Visualisation des CDB radio-induites par les anticorps d’une protéine de réparation (Rad51) (vert) et de l’histoneg-H2AX (rouge) indicateur de CDB (Aten JA Science Jan 2;303(5654):92-5) A: Rad51 B & C: Rad51 + -H2AX ; 30 min D & E : Rad51 + -H2AX ; 60 min

37 Induction de CDB radioinduites par la phosphorylation de l’histone H2AX
(Rothkamm et Löbrich, PNAS 2003;100: )

38 Dommages endogènes et radio-induits de l ’ADN
Dommages endogènes radio-induits /cellule/jour /Gy Cassures simple brin à Pertes de bases ? Dommages de bases Cassures double brin Pontages ADN/ADN Pontages ADN/protéine quelques-unes Lésions multiples localisées (LMDS) quelques-unes? ? (selon Burkart W et al. CR Acad Sci III 1999; 322:89-101; Ward JF Prog Nucl Acdids Res Mol Biol. 1988; 35: )

39 5 grandes classes de modifications:
Les lésions de l’ADN Ce sont des modifications accidentelles ou provoquées qui aboutissent à une anomalie de la constitution physique ou chimique de l’ADN 5 grandes classes de modifications: Modifications des 2-désoxyriboses de l’ADN (par arrachement d’atome d’hydrogène par les radicaux *OH) ---> cassures simple et double brin (CSB, CDB), sites abasiques oxydés (2’-désoxyribonolactone) (formation de pontages avec Endo III,Fpg,Neil1, Pol beta, voir Barker et al. 2005) Modifications des bases (environ 70) (seulement 8 détectées dans l’ADN cellulaire, voir Cadet et al.Free Radic Biol Med 33, , 2002) Pontages ADN - protéines (8-oxo dGuo/lysine de la protéine MutY, HickersonR.P. et al. 1999, Barker S. et al. 2005) Adduits exocycliques entre les bases de l’ADN et des aldéhydes ---> Pontages intra-et interbrins ? (P. Regulus et al. 2006, in press)

40 Radiolésions formées dans l’ADN de monocytes humains (THP1)
après irradiation g (selon Pouget et al. Radiat. Res, 17, , 2002) Radiolésions Nombre de lésions/109 bases/Gy Diols de thymine 97 FapyGuo 39 5-HmdURD 29 5-FordUrd 22 8-oxo-dGuo 20 FapydAdo 5 8-oxo-dAdo 3 5-OH-dUrd <0,2

41 Lésions de l’ADN radioinduites
(1) base endommagée (2) site abasique (3) cassure simple brin (CSB) sucre endommagé (4) site alcali-labile (5) pontage intra-brin (6) pontage inter-brins dimère (TT,CT,CC) pontages P-P ou Py-Py (7) bases endommagées sur les deux brins (8) bases endommagées et cassure simple brin en face (8) cassure double brin (CDB) et/ou dommages multiples localisés (“LMDS”)

42 Photoréactions des rayons ultraviolets avec l’ADN
Radiation Chromophores Réaction Photoproduits - Py-Py dimères, - produits 6-4, - isomères Dewar Dimérisation 240 UVC ADN 280 Type I Modifications de bases, CSB Oxydations de bases Pontages ADN-Protéines S* UVB Agents S photo- dynamiques 1S - exogènes (psoralènes) Type II 320 1O2 3S O2- H2O2 OH° 360 UVA Fe3+ C4-adduits Pso<>Pyr 400 visible

43 Photoproduits induits par les rayons UVB

44 Photolésions (nombre/ 109 bases) induites par UVB et UVA
dans les cellules de hamster chinois CHO

45 Dommages oxydatifs induits par les rayonnements UVA et gamma
dans les monocytes humains a) HPLC-ECD b) HPLC/GC-MS c) test de comètes

46 Radiation solaire Radiation ionisante Pollution chimique
Endommagement de l’ADN: Métabolisme oxydatif ----> cassures simple brin et lésions oxydatives Soleil ---> Dimères de pyrimidines, lésions oxydatives, cassures simple brin Radiation ionisante ----> dommages multiples sur tous les composants de l’ADN (cassures simple et double brin, dommages de bases, pontages intra-et interbrins, pontages ADN-protéine) Agents chimiques ---> formation d’ adduits et de pontages ADN-ADN et ADN-protéines Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

47 Interaction des radiations ionisantes avec l’ADN
et conséquences biologiques Radiation ionisante Létalité Cancer Dommages de l’ADN Survie Mutations Effets: - directs - indirects Signalisation des dommages Réparation de l’ADN Dommages membranaires et cytoplasmiques Génome Génome intact Arrêt du cycle cellulaire

48 Contrôle de l’intégrité de l’ADN
L’état de l ’ADN est constamment contrôlé à la fois en vue: de la réplication du repérage des lésions Fourche de réplication de l ’ADN Quand une lésion est repérée, des signaux sont émis afin de mobiliser les systèmes enzymatiques de réparation. Au moment où les ADN polymérases rencontrent la lésion, les stratégies réplicatives sont modifiées pour permettre la réparation et/ou le dépassement de cette lésion (par synthèse translésionnelle). Certaines systèmes de réparation fonctionnent de concert avec l’activité de l’ADN (ex.: l’excision de nucléotides couplé à la transcription) Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

49 Voies de signalisation
Dommage de l ’ADN Signalisation Arrêt du cycle Réparation Apoptose

50 Apoptose Irradiation Phase d’induction ATM SMase p53 Sphingomyéline
Sphingosine- 1-phosphate Sphingomyéline Céramide Sphingosine SAPK/JNK Mitochondrie Sphingosine kinase ERK Phase d’exécution PKC Caspases Survie cellulaire Clivages de PARP, DNA-PKcs, ICAD -----> Fragmentation de l’ADN

51 Signalisation par la protéine ATM
Bakkenist CJ et Kastan MB, Cell 2004;118:9-17

52 UV RI Détecteurs Transmetteurs ATR/ ATM Effecteurs CHK1 CHK2 p53
TopBP1 XPE Rad1 Rad50 TT Rad17 Nbs1 Rad9 Pol  XPC-HR23AB Mre11 Détecteurs Hus1 CDB Bloc de réplication CDB compl. P Nbs1Rad50 Mre11 Transmetteurs ATR/ ATM Ku70/80 DNA-PKcs P P P P P Effecteurs CHK1 CHK2 p53 BRCA1 NHEJ HR Effets Réparation / Arrêt du cycle Arrêt G2/M Arrêt G1/S Apoptose

53 (Melo J, Toczyski D, Curr Opin Cell Biol 2002 14(2):237-245)
S. pombe S. cerevisiae H. sapiens Cds1 =Chk2 Chk1 Rad53 Dommages en G2 Dommages intra-S Chk2 Rad3 Mec1 BRCA1 ? ATM M/R/N Senseurs Claspin? ATR ATRIP Arrêt du cycle Mrc1 Crb2 Rad9 Cassures double-brin Autres types de dommages Dommages Médiateurs Effecteurs Arrêt du cycle Arrêt du cycle (Melo J, Toczyski D, Curr Opin Cell Biol (2): )

54 Réponse aux radiations et aux stress oxydatifs
Dommages de l ’ADN réparés Cellules normales Progression du cycle cellulaire Arrêt du cycle et réparation Dommage de l ’ADN Endommagement de l ’ADN excessif Instabilité génomique Cancérogénèse augmentée Sélection clonale des cellules résistantes à l ’apoptose APOPTOSE

55 Ecole Doctorale de Cancérologie
Master 2 de Physique Médicale PARIS XI ( ) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables: J.M. COSSET-J. BOURHIS RB1.9 Lésions radio-induites de l’ADN: Mécanismes de réparation Inhibiteurs de la réparation Dr. Dietrich Averbeck Institut Curie-Section de Recherche Laboratoire Raymo,nd Latarjet Bâtiment 110 Centre Universitaire d’Orsay F ORSAY Cedex Tél ;FAX: Cours le Jeudi 2 Novembre h00 à 12h30 Faculté Kremlin Bicêtre,63 rue Gabriel Péri,94276 Kremlin Bicêtre, Salle Pinel

56 Stratégies de la réparation
CSB 1. Réversion in situ du dommage. ou 2. Excision de dommages a) Réparation des mésappariements b) Excision de bases modifiées Action spécifique de DNA-N-glycosylases sur un type de lésion (base altérée) Réparation des CSB (intervention de PARP1) PARP1 3. Excision de nucléotides modifiés 4. Réparation post-réplicative par recombinaison (homologue) réplication brèche incorporation réparation CDB 5. Réparation par recombinaison homologue (échange entre deux brins des deux ADN) CDB 6. Réparation par religation non-homologue (après façonnage ligation avec perte du matérial. Ligation avec délétion)

57 par O6-méthyltransférase réversion par la photolyase
Réparation de l’ADN par réversion du dommage dimère de pyrimidine cassure simple brin méthyl O6 Gua 3’-OH G TT 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ élimination du méthyl par O6-méthyltransférase réversion par la photolyase ( chez les marsupiaux) réversion par l’ADN ligase I G TT ADN reconstitué Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

58 Réparation des photolésions induites dans la peau par les rayons ultraviolets (UVB)
Témoin 2MED UV min min 30 min (D ’après H. Stege et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: )

59 contenant des protéines (photolyases)
Réparation de dommages induits dans la peau par le soleil: application d’une crème contenant des protéines (photolyases) capables d’effectuer la réparation des photolésions dans l’ADN Crème après-soleil Réparation

60 Ligation des cassures simple brin avec 3’-OH et 5’-P termini
par l’ADN-ligase 3’ 5’ O O 3’ 5’ OH P ADN-ligase, NAD ou ATP O- O- 5’ 3’ O 5’ 3’ O O P O- + AMP + nicotinamide mononucléotide ou Phosphodiphosphate

61 Réparation de bases mal appariées
Reconnaissance de la base mal appariée Protéines: hMutSa complexe (hMSH2/hMSH6) Elimination de la base mal appariée hMLH1/hPMS1 Synthèse de réparation par l’action d’une polymérase d PCNA, RPA, RFC, FEN1 Action de l ’ ADN ligase IV Reconstitution de l’intégrité de la structure de l’ADN (60% des cancers héréditaires colorectaux non polyposiques sont liés aux mutationsde hMSH2, 35% des cancers du colon sont liés aux mutations dehMLH1)

62

63 (Friedberg 2003)

64 Excision de bases 1. reconnaissance 2. excision 3. remplissage
Base endommagée 1. reconnaissance ADN glycosylases 2. excision AP endonucléase Synthèse par pol  ou pol+ PCNA+ FEN 3. remplissage ADN ligase I ou ADN ligase III/XRCC1 4. reconstitution de l’ADN ADN réparé Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

65 Remplissage des brèches
Excision de bases Base endommagée Remplissage des brèches Pol b (1à 2 nt ) (activité dRpase) Pol b, pold / e (2 à 8 nt ) + FEN-1 + PCNA AP Lyase / endonucléase hAP1 Ligation ADN ligase III/XRCC1 ADN reconstitué CSB XRCC1/Lig III PNK ADN-glycosylases (Ogg1,Fpg) ADN ligase I PARP1 site AP

66 Induction de cassures dans l ’ADN de lymphocytes humains révélée
par le TEST des Comètes après une activité physique exagérée (tapis roulant) 4,5 4 3,5 individu A 3 2,5 individu B Index de fragmentation de l ’ADN (UA) 2 individu C 1,5 1 0,5 0h 6h 24h 48h 72h 96h Temps (d ’après A. Hartmann et al Mutagenesis 1994;9: )

67 Excision de nucléotides
Réparation normale (avec XPC/ hHR23B) TT Réparation d’urgence Réparation couplée à la transcription (TCR) (avec RNAPol II /CS-B) TT Reconnaissance et séparation des brins (TFIIH/ XPA/RPA/XPB/XPD) TT Incision et excision de la lésion avec ciseaux moléculaires (ERCC1/XPF + XPG) Remplissage par une synthèse réparatrice par Pol/ Reconstitution de l’intégrité de l’ADN par l’ADN ligase 1 Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

68 NER Réparation couplée à la transcription Réparation globale 5’ 3’ 5’
XPA XPE XPC/hHR23B Lésion RNAPol II 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ CS A, CS B, XPG(?) TFIIH XPA RPA TFIIH Reconnaissance de la lésion et séparation des brins d’ADN XPA RPA XPB XPD XPG ERCC1/XP-F incision 3’ incision 5’ Incision de deux côtés de la lésion 5’ 3’ 3’ 5’ Excision de l’oligonucléotide portant la lésion, synthèse et ligation Pol d/e, PCNA Synthèse réparatrice Ligation par l’ADN ligase I

69 Réparation par excision de nucléotide (NER):
GG-NER et TCR-NER (en rouge: facteurs liés aux phénotypes de vieillissement )

70 Colocalisation de protéines d’excision de nucléotides après
une irradiation UV à travers une grille (selon Gillet LCJ,Schärer OD. Chem.Rev.2006;106: ) (visualisation par des anticorps dimères ou XPA ou XPC spécifiques)

71 Variabilité individuelle des capacités de réparation de
photolésions (dimères) chez 13 volontaires après exposition à 40mJ/cm2 d’irradiation solaire simulée (selon G. Xu et al. Mutation Res. 2000;459: ) Photolésions résiduelles (%) Temps de réparation Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

72 Diminution de la capacité de réparation avec l’âge
Diminution de 0,62% par an de la capacité de réparation dans les lymphocytes humains in vitro (selon Q. Wei et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: et S.I. Moriwaki et al. Mutat. Res. 1996; 364: ) Capacité de réparation diminuée dans certains cancers: - Carcinome basocellulaire (J. Alcalay et al. J. Invest. Dermatol. 1990; 95: ) - Cancer du poumon (D. Li et al. Cancer Res. 1996; 56: et Q. Wei et al. Cancer Res. 1996; 56: ). - Cancer du colon ( R. W. Pero et al. J. Natl. Cancer Inst. 1993; 70: ) - Cancer du sein (E. Kavas et al. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1986; 22: ) Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

73 Façonnage et recherche
Réparation d’une CDB par recombinaison homologue RI CDB hRad52 5’ 3’ 5’ 3’ Reconnaissance hRad51 Rad50/Mre11/Nbs1 complexe Dommage Façonnage et recherche d’homologie ADN homologue Recombinaison homologue entre les deux ADN Invasion et échange de brins Ligation par Ligase I Ligation Reconstitution fidèle de l’ADN

74 Réparation des CDB par recombinaison homologue

75

76 (Schultz N. et al. Nucl Acids Res. 231(17)(2003),4959-4964)

77 Induction et réparation de CDB radioinduites
A: MRC-5 fibroblastes B: 180 BR fibroblastes: déficients dans la réparation (ligase IV) (Rothkamm et Löbrich, PNAS 2003;100: )

78 Induction et réparation de CDB après des faibles doses de rayons X
Absence de réparation à très faible dose (1,2 mGy) (Rothkamm et Löbrich, PNAS 2003;100: )

79

80 L’effet du débit de dose sur l’induction de CDB
dans les cellules de mammifère implique une réparation par religation non homologue (‘NHEJ’) Cellules CHO-K1 Mutant xrs-6 60 60 50 R 2 = 0,9727 50 40 40 R 2 = 0,9922 LDR LDR FAR (%) 30 FAR (%) 30 HDR HDR 20 20 R 2 = 0,9478 R 2 = 0,9864 10 10 10 20 30 40 10 20 30 40 Dose (Gy) Dose (Gy) Irradiation gamma: LDR: faible débit (0.05 Gy/min) HDR: haut débit (3.5 Gy/min)

81 Absence de signalisation des CDB à très faible débit de dose
selon Collis et al. JBC 2004, Sept 14 Survie Ind. g-H2AX Dose (Gy) Dose (Gy) En prenant l ’activation de H2AX (phosphorylation par ATM) comme indicateur des CDB radio-induites, les auteurs montrent qu ’à très faible débit de dose (94 mGy/h), les CDB ne sont pas réparées car elles ne sont pas reconnues par les protéines détectrices (MRE11-RAD50-NBS1) à cause d’ un défaut dans l ’activation d ’ATM. ----> Comme dans le cas des faibles doses, un seuil de débit de dose semble exister pour la signalisation par ATM et pour la réparation .

82 Stratégies pour la réparation non fidèle des dommages ou leur tolérance
1. La religation non homologue des cassures double brin. (« non homologous end-joining= NHEJ ») Soudure des ruptures de l’ADN après façonnage et stabilisation par des protéines permettant à une ligase la religation. Ce processus n’est pas fidèle mais est efficace pour assurer la survie cellulaire après irradiation. Par exemple, ce processus permet la réparation de cassures double brin radioinduites pendant une irradiation à faible débit de dose. 2. La synthèse de l’ADN translésionnelle. Grâce à des protéines ignorant plus ou moins la présence des lésions une synthèse d ’ADN peut avoir lieu. Dépendant de la performance des protéines impliquées dans la polymérisation de l’ADN (les polymérases h ou z ) la synthèse de l’ADN est assez fidèle (polymérase h) ou non fidèle (polymérase z). Les patients atteints de la maladie Xeroderma pigmentosum variant prédisposant au cancer de la peau induit par le soleil sont porteurs d’une protéine polymérase h altérée. Il en résulte une hypermutabilité conduisant aux cancers multiples. lésion synthèse mutation Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

83 Réparation de CDB par religation non homologue (NHEJ)
Radiation ionisante DSB Reconnaissance 5’ 3’ 3’ 5’ DNA-PK Ku70/80 Recrutement et façonnage Artemis Cernunos/XLF Alignement DNA ligase IV /XRCC4 Ligation Reconstitution non fidèle de l’ADN

84 Religation (suture) non homologue
‘Non-homologous end-joining (NHEJ)’ (selon SJ. Collis et al. Oncogène 2004)

85 Réparation des CDB par religation non-homologue (NHEJ)

86 Wild-type scid Urushibara A et al. Biochem. Biophys.Res. Commun.
313(2004) Dose rayons X (Gy) Fraction de survivants Wild-type scid

87 Rothkamm K. et al. 2004

88 Cinétiques de réparation des CDB radioinduites
Lymphoblastes Cellules CHO 100 cellules temoins BRCA1 +/- 80 BRCA2+/- p53+/- 60 ATM-/- 40 20 100 200 300 Temps d’incubation (min) Temps d’incubation (min)

89 Urushibara A et al. Biochem. Biophys.Res. Commun. 313(2004)

90 Aberrations chromosomiques complexes après irradiation g

91 Signalisation de la présence de dommages
----> par des protéines comme ATM, ATR. Reconnaissance des dommages ----> par les glycosylases (dommages oxydatifs), les protéines XPA, XPE (nucléotides), les protéines PARP, hRad52, Ku 70/80 et la DNA-PKcs (CSB et CDB ) Stratégies de la réparation de lésions radio-induites et tolérance des lésions Systèmes Activité Fidélité Réversion du dommage religation des CSB réparation fidèle Excision de bases dommages oxydatifs, CSB réparation fidèle Réparation des mésappariements réparation des de bases erreurs réplicatives réparation fidèle Excision de nucléotides dimères Py-Py et adduits réparation fidèle Recombinaison homologue CDB, pontages,“LMDS”? réparation fidèle Religation non homologue (“NHEJ”) CDB et “LMDS” réparation infidèle Synthèse translésionnelle, tolérance de la lésion ou “Bypass” (dommages de bases et adduits): ----> réparation fidèle ou infidèle dépendant de la lésion et de la polymérase impliquée ( ou )

92 Systèmes de réparation des radiolésions (1)
(voir Averbeck D. Cancer/Radiothérapie 2000;4:1-20) 1. Réversion directe de certaines cassures simples brin par une enzyme, la ligase I. 2. Réparation des bases mal appariées : élimination de ces bases et insertion de bases correctes par un processus multienzymatique. 3. Excision de bases modifiées et réparation des cassures simple brin (BER): - élimination par excision enzymatique des bases par des glycosylases et des endonucléases (Fpg, Nth,Nfo,Ape1, Ogg1) - réparation de sites abasiques - reconnaissance enzymatique (par la Poly(ADP-ribosyl) transférase, PARP) et réparation des cassures simple brin: après façonnage des brins, insertion de nucléotides corrects (1 à 5) et ligation des brins 4. Excision de nucléotides: système très spécialisé dans l’excision des lésions encombrantes (glycols de thymine, dimères etc.) peu souvent induites après irradiation ionisante.

93 Systèmes de réparation des radiolésions (2)
5. Réparation des cassures double brin (CDB) par recombinaison homologue: système fidèle nécessitant la présence de l’ADN homologue, donc dépendant de la phase du cycle cellulaire. La réparation implique (1) une reconnaissance des CDB par un complexe protéique (Mre11 Rad50,Nbs1) (2) une recherche d’ADN homologue (Rad51, Rad52) (3) un échange de brins d’ADN (4) une résolution des jonctions (résolvase, polymérase) (5) une ligation des brins par la ligase I 6. Réparation des cassures double brin (CDB) par religation non homologue: système de réparation souvent fautif car il implique une religation de brins endommagés après un façonnage. La réparation implique (1) une reconnaissance des CDB par des protéines (Ku70/80, DNA-PKcs) (2) un façonnage (3) une ligation des brins par des enzymes (XRCC4 and ligase IV)

94 Reconnaissance du dommage (ATM/ATR/PARP/p53/BRCA1/BRCA2)
Réparation des dommages radioinduits de l ’ADN Radiations ionisantes ADN endommagé Reconnaissance du dommage et signalisation (ATM/ATR/PARP/p53/BRCA1/BRCA2) Synthèse translésionnelle hREV3 hRAD30 Réparation des mésappariements Excision de nucléotides Recombinaison homologue Religation non homologue Excision de bases hMLH1 hMSH2 hOGG1,hNTH HAP1, Polb, XRCC1 LIG3 XPA, B,C, D, XPE, F, G CSA, CSB hRAD50/ MRE11/NBS1 hRAD51 hRAD52 hRAD54 XRCC2 XRCC3 XRCC5 (KU86) XRCC6 (KU70) XRCC7 (DNA-PK) XRCC4 LIG4

95 Tolérance du dommage par synthèse translésionnelle
(voir également: Lehmann AR, Exp. Cell Res. 2006;312: ) agent génotoxique (UV,RI) dommage de l’ADN TT 3’ 5’ 5’ 3’ blocage de la réplication normale de l’ADN TT 3’ 5’ 3’ 5’ synthèse translésionnelle Pol  Pol  fidèle TT TT fautive AA AC Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

96 Quelques déficiences de la réparation de l’ADN chez l’homme

97 Certains gènes de réparation mutés chez les patients atteints
de syndromes d ’hypersensibilité à divers agents génotoxiques prédisposent au cancer (1)

98 Certains gènes de réparation mutés chez les patients atteints
de syndromes d ’hypersensibilité à divers agents génotoxiques prédisposent au cancer (2) Gènes CS (Cockayne) et TTD (trichothiodystrophie) - hypersensibilité aux rayons ultraviolets - affectent la réparation par excision de nucléotides - syndromes de transcription (les sous-unités du facteur de transcription TFIIH sont affectées) - absence de prédisposition pour les cancers de la peau Gènes MSH2 et MLH1 - affectent la réparation des mesappariements de bases - prédisposition pour le cancer non-polyposique du colon Gène BLM (syndrome de Bloom) - affecte l ’action hélicase (impliqué dans la réparation) - instabilité chromosomique et génétique

99 Certains gènes de réparation mutés chez les patients atteints
de syndromes d ’hypersensibilité à divers agents génotoxiques prédisposent au cancer (3) Gène ATM (Ataxia telangectasia) (MF. Lavin et al. 1995, Bay et al. 2000) - hypersensibilité aux rayons gamma - affecte la réparation des CDB à faible débit de dose - affecte la progression dans le cycle cellulaire après irradiation gamma - affecte la phosphoinositidyl 3-kinase - prédispose aux cancers (leucémies et lymphomes) - en condition hétérozygote (prédisposition pour le développement de cancers du sein) Gène FANCC (Anémie de Fanconi) - hypersensibilité aux agents pontants - instabilité chromosomique - affecte la réparation des pontages intra -et interbrin

100 Réponses aux agents génotoxiques
Activités cellulaires et agents chimiques endogènes Radiations ionisantes Radiations ultraviolettes Agents chimiques Sites AP, CS, (CDB) dommages oxydatifs bases modifiées, erreurs replicatifs Sites AP,CSB,CDB, dommages oxydatifs, bases modifiées, LMDS, pontages PP dimères, bases modifiées pontages Adduits, cassures, pontages Dommages supportables Dommages excessifs Signalisation Signalisation Voie de l’apoptose Rép. fautive Arrêt du cycle Stress Réparation Mutations Aberrations chrom. Survie cellulaire normale Transformation Mort cellulaire

101 DOMMAGES DE L ’ADN - MÉCANISMES DE RÉPARATION
CONSÉQUENCES DES DOMMAGES

102 Ecole Doctorale de Cancérologie
Master 2 de Physique Médicale PARIS XI ( ) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables: J.M. COSSET-J. BOURHIS RB1.9 Lésions radio-induites de l’ADN: Mécanismes de réparation Inhibiteurs de la réparation Dr. Dietrich Averbeck Institut Curie-Section de Recherche Laboratoire Raymo,nd Latarjet Bâtiment 110 Centre Universitaire d’Orsay F ORSAY Cedex Tél ;FAX: Cours le Jeudi 2 Novembre h00 à 12h30 Faculté Kremlin Bicêtre,63 rue Gabriel Péri,94276 Kremlin Bicêtre, Salle Pinel

103 Pourquoi s’intéresse-t-on aux inhibiteurs de la réparation?
Les radiations ionisantes, les agents chimiothérapeutiques et les rayons ultraviolets sont capables d’empêcher la division cellulaire par l’induction de lésions dans l’ADN. La radiothérapie et la chimiothérapie visent l’élimination des cellules cancéreuses. Quelques tumeurs s’avèrent résistantes contre ces traitements à cause d’une capacité de réparation plus élevée. Il est donc nécessaire d’inhiber cette réparation. Il est important de mieux comprendre le mode d’action de chaque système de réparation de l’ADN et les possibilités d’inhibition afin d’améliorer l’efficacité des traitements anticancéreux.

104 Inhibition de la réparation de l’ADN est possible à différents niveaux (1)
A. Apport des précurseurs nucléotidiques pour combler les brèches apparues pendant la réparation: de mésapariements de bases après reconnaissance par des protéines MutS,MutL,PCNA etc. et excsion de la base mésappariée par EXO1 et d’autres facteurs enzymatiques ----> puis synthèse par la polymérase delta + PCNA +RPA par excision des dommages de bases (oxydées ou non) par des ADN glycosylases spécifiques et/ou des AP endonucléases ---> puis synthèse par la polymérase beta ou delta + PCNA + FEN par excision de nucléotides par les endonucléases ERCC1/XPF et XPG ---> puis synthèse par les polymérases delta ou epsilon par recombinaison homologue après reconnaissance et/ou façonnage du CDB par le complexe Rad50/Mre11/NBS1(Xrs2) avec l’intervention de rad52 et rad52 ----> puis synthèse par une polymérase par religation non homologue (NHEJ) après reconnaissance du CDB avec l’intervention de Ku70/Ku80 et DNA-PKcs

105 Inhibition de la réparation de l’ADN est possible à différents niveaux (2)
B. Inhibition des enzymes impliquées dans la réparation de l’ADN: -Methyl transférase (O6-alkylguanine DNA méthyl transférase: inhibition par l’ O6 - Benzylguanine (essais cliniques en phase I sur patients atteints de lezucémies lymphoïdes chroniques). L’ O6 -benzylguanine est particumièrement active en jonction avec des traitements par des alkylants nitorosourés comme le BCNU. - Polymérases (alpha, beta) par l’aphidicoline et la didéoxythymidine (dThTTD) - PARP-1 par le 3-aminobenzamide et d’autres dérivés - Protéine kinases (phosphoinositydil 3 kinases P3K): ATM, ATR et DNA-PKcs par la wortmannine, la caféine, etc.

106 Hydrolyse de liaisons N-glycosidiques

107

108 Cellules MCL-5 après Rayons gamma Formation de cassures (F.L. Martins et al. Mutat Res. 445(1999)21

109 Excision de nucléotides

110

111 (2 ’,2 ’-difluoro2 ’-désoxycytidine ou dFdC)
Gemcitabine (2 ’,2 ’-difluoro2 ’-désoxycytidine ou dFdC) (selon Pauwels B et al. , The Oncologist 2005)

112 Différentes classes d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN (suite)

113 Rôle de la PARP-1 dans la réparation des CSB

114 Structure de la PARP (Jagtap P, Szabo C. Nature Rev
Drug Discovery 4 May 2005: )

115

116 (Kim MY, Zhang T, Kraus WL Genes Dev 2005 ;19(17):1951-1967)

117 Rôles de la PARP Régulation et signalisation PARP-1 automodification, Catabolisme, NAD+ métabolisme Biologie moléculaire et cellulaire Détection des CSB de l’ADN et réparation Voie métabolique de l’apoptose, Structure de la chromatine, Transcription Fonction dans la mitose Physiologie et Pathophysiologie Maintien du génome, Carcinogenèse, Vieillissement Réponses inflammatoires, Fonctions neuronales

118 Inhibiteurs de la PARP (selon Martin NMN, J PhotochemPhotobiol 2001;63:162-170)

119

120 Religation non homologue
(« non homologous end-joining » (NHEJ) (selon M. Christmann et al. Toxicology, 2003)

121 Inhibiteurs de phosphoinositydil 3 kinases

122

123 Wortmannin inhibits repair of DNA double-strand breaks in irradiated
normal human cells (R. Okayasu et al. Radiat. Res. 149, (1998))

124 Différentes classes d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN (suite)

125 Mécanisme de l’interférence ARN (Schwarz et al. Cell 2003;115:199-208)
ARN double-brin (shRNA) siRNA synthétique ATP Dicer ADP + P Pré-miRNA Désappariements par l’activité Hélicase du Dicer Dégradation du brin sens Incorporation du brin guide dans le complexe RISC ARNm AAA..An AAA..An Répression de la traduction Dégradation de l’ARNm Réduction de l’expression de gènes par l’extinction spécifique d’un gène cible

126

127 Différentes classes d’inhibiteurs de la réparation de l’ADN (suite)