LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON

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Transcription de la présentation:

LE MILIEU DE HUGH ET LEIFSON
Source de C et N Composition Source de C, N, minéraux et vitamines Peptone pancréatique de caséine 2 g Extrait de levure 1 g Chlorure de sodium 5 g Phosphate monopotassique 0,3 g Glucose g Bleu de Bromothymol 0,03 g Agar (gélose) 3 g ED qsp 1 L Équilibre ionique Source de P Source de C à rajouter Indicateur de pH Vert pH basique ou neutre, jaune pH acide solidification du milieu gélose semi solide pH = 7,2 Milieu aqueux

Technique d’ ensemencement
1- Régénérer le tube 20 minutes au bain marie bouillant 2- Ajouter le volume de solution de glucose stérile dans le milieu en surfusion: à 45°C 3- A jouter trois gouttes de suspension bactérienne et refroidir immédiatement le tube sous l’eau froide. 4- Ne pas visser le tube à fond 5- Incuber 24 heures à 37°C lecture Virage de l’indicateur de pH au jaune dans tout le tube. Le milieu est devenu acide. Il y a eu production d’acides lors de l’utilisation du glucose par les bactéries en présence et en absence d’O2. Les bactéries sont fermentatives vis-à-vis du glucose. Virage de l’indicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube. Le milieu est devenu acide. Il y a utilisation du glucose par les bactéries en présence d’ O2. Les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose. Le milieu reste tel qu’il était avant ensemencement. Il n’y a pas de culture. Les bactéries sont inertes vis-à-vis du glucose

Le milieu Citrate de Simmons
Composition Sulfate de magnésium 0,2 g Phosphate monopotassique 1 g Phosphate bipotassique 1 g Citrate de sodium 2 g NaCl g Bleu de Bromothymol 0,08 g Agar (gélose) 15 g ED qsp 1 L Sources minérales Seule source de C Equilibre osmotique Indicateur de pH Vert pH basique ou neutre, jaune pH acide pH = 6,8 6 7,6 Ensemencement Faire une strie centrale avec une suspension en eau physiologique ou directement à partir d’une colonie Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C

Milieu de Clark et Lubs pH = 7 Composition
Peptone trypsique ou polypeptone 5 à 7 g Glucose 5 g Phosphate bipotassique 5 g ED qsp 1 L Sources minérales Source de C Source minérale pH = 7 Ensemencement Ensemencer avec 5 à 10 gouttes de suspension bactérienne. Ne pas visser le bouchon à fond Incuber 24 h à 37°C Test RM Après incubation, prélever 2 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse. Ajouter 1 à 2 gouttes de rouge de méthyle. Observer. 4,5 6,8 Test VP Après incubation, prélever 1 mL du milieu et les déposer dans un tube à hémolyse. Ajouter 0,5 mL d’-naphtol et 0,5 mL de soude. Mélanger et incliner le tube. Faire la lecture après 10 à 15 min de contact.

Milieu de Kligler Hajna
Composition Extrait de viande de boeuf 3 g Extrait de levure 3 g Peptone g Chlorure de sodium 5 g Citrate ferrique 0,3 g Thiosulfate de sodium 0,3 g Lactose g Glucose g Rouge de phénol 0,05 g Agar (gélose) 12 g ED qsp 1 L Source de C et N Equilibre osmotique Mise en évidence de la formation H1 S Source de soufre, témoin d’oxydo-rédcution Source glucidique majoritaire Source glucidique minoritaire pH = 7,4 Indicateur de pH 6,5 8,2 Ensemencement 1) Stries serrées sur la pente Öse ou pipette boutonnée 2) Piqûre centrale dans le culot Fil droit ou pipette boutonnée

Milieu mannitol mobilité nitraté
Composition peptone g Nitrate de potassium 2 g Mannitol g Rouge de phénol à 1 % 4 mL gélose 4 g ED qsp 1 L Sources de C et N Apport de nitrates Source de C Indicateur de pH pH = 8 Ensemencement Piqûre centrale avec le fil droit

Lecture des milieux Citrate de Simmons
1ère lecture possible 2nde lecture possible Le milieu présente une culture, l’indicateur de pH a viré au bleu  le milieu est devenu basique. Les bactéries ont utilisé le citrate comme source de carbone en produisant des composés alcalinisant le milieu: CITRATE + Le milieu ne présente aucune culture. Les bactéries n’utilisent pas le citrate comme source de carbone : CITRATE -

Clarck et Lubs 1- Test RM 2- Test VP 1ère lecture possible 2nde lecture possible 1ère lecture possible 2nde lecture possible Le milieu est devenu rouge  le pH est acide . Il y a eu formation de composés acides par les bactéries au cours de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie des acides mixtes : RM +. Le milieu est devenu jaune  le pH est basique . Les bactéries n’utilisent pas la voie des acides mixtes lors de la fermentation du glucose : RM -. Formation d’une coloration rouge en surface . Il y a formation d’acétoïne et de butanediol dans le milieu lors de la fermentation du glucose. Les bactéries utilisent la voie du butanediol : VP +. Pas de modification du milieu . Les bactéries n’utilisent pas la voie du butanediol lors de la fermentation du glucose : VP -.

Mannitol mobilité 1- Utilisation du mannitol 2- Mobilité 1ère lecture possible 2nde lecture possible 1ère lecture possible 2nde lecture possible Le milieu est resté rouge  le pH est neutre ou basique . Les bactéries ne fermentent pas le mannitol : MANNITOL -. Le milieu est devenu jaune  le pH est acide . Les bactéries fermentent le mannitol et produisent des acides qui acidifient le milieu : MANNITOL +. Observation d’une culture dans tout le tube. Les bactéries ont diffusé dans tout le milieu : elles sont MOBILES. Culture uniquement au niveau de la piqûre centrale. Les bactéries sont IMMOBILES.

Kligler Hajna Précipité noir de sulfure ferrique Pas de précipité noir
1- lecture de la production d’H2 S 2- lecture de la production de gaz Précipité noir de sulfure ferrique Pas de précipité noir Production d’H2S par les bactéries ! H2S+ bactéries ! H2S- Présence de bulles dans la gélose Pas de bulle dans la gélose Les bactéries produisent du gaz (H2 ou CO2) au cours de leur fermentation : GAZ + bactéries ! GAZ -

Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE +
3- Lecture de l’utilisation du lactose Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE - Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE + Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE + Acidification du milieu en aérobiose lors de l’utilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif Le milieu reste orangé. Les bactéries n’utilisent pas le glucose et le lactose. GLC - et LAC - Pente jaune Culot rouge

Recherche de la -galactosidase
2) Ajouter stérilement un disque ONPG 1) Faire une suspension épaisse à partir de colonies prélevées sur la pente Elle s’effectue sur un tube de Kligler LAC - 3) Incuber à 37°C pendant 30 minutes 1) Le tube reste incolore.  absence de la -galactosidase : ONPG - 2) La suspension est colorée en jaune  présence de la -galactosidase : ONPG +, mais absence de la perméase.

Kligler Hajna Présence de bulles dans la gélose
1- lecture de la production d’H2 S 2- lecture de la production de gaz Pas de précipité noir Présence de bulles dans la gélose Pas de bulle dans la gélose bactéries ! H2S- Les bactéries produisent du gaz (H2 ou CO2 a)u cours de leur fermentation : GAZ + bactéries ! GAZ - Précipité noir de sulfure ferrique Production d’H2S par les bactéries ! H2S+ 3- Lecture de l’utilisation du lactose Alcalinisation de la pente, les bactéries ne fermentent pas le lactose: LACTOSE - Tube jaune Pente jaune Tube orange Pente rouge Culot rouge Culot jaune Acidification du milieu en aérobiose lors de l’utilisation des glucides : LAC + et GLC + oxydatif Acidification de tout le milieu lors de la fermentation des glucides : GLUCOSE + et LACTOSE + GLC - et LAC - Acidification du culot lors de la fermentation du glucose : GLUCOSE +