activité télomérase élevée

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1 activité télomérase élevée
cellules souches embryonnaires (ES) totipotentes ovocyte fécondé Stade 8 cellules blastocyste auto-renouvellement activité télomérase élevée pluripotence Endoderme Pancréas Thyroïde Poumon Intestin Hépatocytes Mésoderme Cardiomyocytes Chondrocytes Adipocytes Lymphocytes, GR Muscle Macrophages Endothéliales Ectoderme Kératinocytes Neurones Crête neurales (mélanocytes, …) Germinales Ovocytes Spermatogonies

2 Différentes possibilités d’induction de tolérance
Transplantation dans des sites « immuno-privilégiés » Différentes possibilités d’induction de tolérance Banque de lignées huES immunotypées (HLA) Induction de tolérance par chimérisme hématopoiétique (MSC) Génération d’une lignée universelle (KO HLA classe ½) transfert nucléaire (clonage thérapeutique)

3 culture des cellules souches embryonnaires
neurones différenciation greffe thérapeutique (autogreffe!!) « Clonage thérapeutique » embryon pré-implantatoire 5 j o u r s e n c u l t u r e ovocyte sans noyau R é - i m p l a n t a t i o n d a n s l ’ u t é r u s (Dolly 1998) noyau adulte cellule adulte « Clonage reproductif »

4 culture des cellules souches embryonnaires
différenciation greffe thérapeutique (autogreffe!!) culture des cellules souches embryonnaires neurones « Clonage thérapeutique » - statut de l’embryon (âge, droit) - dignité humaine (statut enfant issu du NT) - marchandisation du corps de la femme - espèces hybride (technique et problèmes) Impossibilité sur l’homme mais: une barrière technique ne peut être une réponse à une question d’éthique. embryon pré-implantatoire R é - i m p l a n t a t i o n d a n s l ’ u t é r u s « Clonage reproductif »

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10 - p53 p53, le gardien du génome Arrêt du cycle réparation apoptose
cellules somatiques S G2 M G1 checkpoint différenciation terminale division asymétrique nanog - p53 induces differentiation of mouse ES cells by suppressing Nanog expression Nat Cell Biol. 2005 G1 G2 M cellules ES S

11 . . . . . Pluripotence des cellules couches embryonnaires (I) 3 5 20
- LIF Cellules ES (+ LIF) Gouttes pendantes 3 Jours de culture et de différenciation Culture en suspension (boites de Pétri) 5 Adhésion et croissance des corps 20 Ectoderme (feuillet externe) Mésoderme (feuillet médian) Endoderme (feuillet interne) Cellules épidermiques Cellules neuronales Cellules cardiaques Cellules musculaires Globules rouges… Cellules pancréatiques Cellules thyroïdiennes Cellules pulmonaires

12 Pluripotence des cellules couches embryonnaires (II)
Cellules ES souris chimérique Recombinaison homologue Cellules ES dont un gène est modifié Injection dans le blastocyste Femelle porteuse

13 Pluripotence des cellules couches embryonnaires (III)
Gut kidney Bone neuroectoderm Tératome: Tumeur bénigne ou maligne formée à partir de tissus multiples étrangers à la région qui l'entoure

14 Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ES
Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales.

15 Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ES
Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales. Tests pharmacologiques: - Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide).

16 Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ES
Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales. Tests pharmacologiques: - Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide). Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I (HES produisent insuline in vivo); infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour réverter un phénotype pathologique.

17 Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ES
Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales. Tests pharmacologiques: - Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide). Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I (HES produisent insuline in vivo); infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour réverter un phénotype pathologique. Délivrance de médicaments production massive de protéines recombinantes ou endogènes…

18 Utilité et perspectives d’utilisation des cellules ES
Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales. Tests pharmacologiques: - Remplacer en partie essais de toxicité sur l’homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide). Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I; infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour corriger un phénotype pathologique. Délivrance de médicaments production massive de protéines recombinantes ou endogènes… Regénération tissulaire contre le viellissement Thérapie des cancers?

19 Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie
* Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines * Contrôler leur différenciation de manière sélective Pureté cellulaire: FACS, sélection génique, clones Contrôler le rejet de tissus Eviter les tératomes (indiff. cells?) * Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires

20 Conditions d’utilisation des cellules ES en thérapie
* Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines * Contrôler leur différenciation de manière sélective * Pureté cellulaire: FACS, antibio, clones Contrôler le rejet de tissus Eviter les tératomes (indiff. cells?) * Problème d’éthique lié à l’utilisation d’embryons surnuméraires

21 La maladie de Parkinson
Prévalence: ~ patients en France Symptômes: Tremblements, Rigidité musculaire, Ralentissement des gestes (akinésie, bradykinésie) Instabilité posturale Pathologie: Perte des neurones dopaminergiques de la substance noire (pars compacta)

22 Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease J KIM*, J M. AUERBACH*†, J A. RODRÍGUEZ-GÓMEZ, I VELASCO, D GAVIN, N LUMELSKY, S LEE†, J NGUYEN†, R SÁNCHEZ-PERNAUTE†, K BANKIEWICZ† & R MCKAY NIH, Bethesda. Modèle animal de la maladie de Parkinson: Administration de 6-OH-DA dans le striatum détruit les neurones dopaminergiques. Commutateur de différenciation: promoteur nurr-1 + SHH + FGF8: - Isolement de neurones DOPA (78%) - Injection des cellules dans le striatum. Marquage anti-Tyrosine Hydroxylase (TH). On retrouve les corps de cellules ES TH+ dans la région de la greffe (a-c) mais des prolongements dans le parenchyme du striatum hôte jusqu’à 2 mm de la greffe (d-g).

23 Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection. 800 rotations/70 min 1 rotation/5 sec

24 Administration d’amphétamine aux animaux lésés par le 6-OH-DA induit une rotation autour du site d’injection. 800 rotations/70 min 1 rotation/5 sec By demonstrating efficacy while avoiding tumour formation, Kim et al. have achieved a proof of principle, although ES cells that have been genetically modified in this way might not be desirable for use in people.

25 Embryos lacking the Id1, Id2, and Id3 genes display multiple cardiac abnormalities and die around E13.5. Reduced myocardial proliferation Discontinous Endocardial cell lining

26 Injection de cellules ES Niches de ES Short-range signals C. Wnt5a, a locally secreted factor, and IGF-1, a bloodstream factor that promotes myocyte proliferation--were identified as potential candidates involved in the rescue process. Injection de IGF-1 ou cellules ES Long-range signals B. Injection of a small number of wild-type ES cells carrying a lacZ marker into Id mutant blastocysts resulted in about 20% chimerism of heart tissue and complete rescue of the Id mutant phenotype.

27 166 genodermatosis (139 genes)
DISORDERS OF KERATINIZATION Ichthyosiform dermatoses Ichthyosis vulgaris X-linked ichthyosis Lamellar ichthyosis Congenital ichthyosiform erythroderma Epidermolytic hyperkeratosis Harlequin fetus Palmoplantar keratodermas Darier disease DISORDERS OF COHESION Epidermolysis bullosa Kindler syndrome PIGMENTATION DISORDERS Oculocutaneous albinism Tyrosinase-negative Tyrosinase-positive Ocular albinism Piebaldism Waardenburg syndrome Incontinentia pigmenti Neurofibromatosis type 1 Neurofibromatosis type 2 Tuberous sclerosis VASCULAR DISORDERS Ataxia-telangiectasia Hereditary hemorrhagic telangiectasia ECTODERMAL DYSPLASIA SYNDROMES Anhidrotic ectodermal dysplasia Hypohidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency Hidrotic ectodermal dysplasia p63-related ectodermal dysplasia Pachyonychia congenita DISORDERS WITH MALIGNANT POTENTIAL Basal cell nevus syndrome Gardner's syndrome Peutz-Jegher syndrome Xeroderma pigmentosum Epidermolysis bullosa syndromes

28 Epidermis Neuroectoderm BMP-4 DORSAL VENTRAL neural cells ectodermal
Noggin Chordin Dorsal Ventral Epidermis Mesoderm Endoderm DORSAL VENTRAL neural cells ectodermal cells (K8/K18) epidermal cells (K5/K14) épiderme Ectoderm Mesoderm dermal fibroblasts derme Gastrulation During embryogenesis, the skin derives from both ectoderm and mesoderm………………… However, to define more precisely their specific functions and rto identify the molecular mechanisms involved, we decided to evaluate the potential of ES cells to recapitulate in vitro the main steps of normal and pathological skin development.

29 neurons ES cells 3 4 11 Days in culture Neural precursors Neural cells
stromal fixed-feeders (- serum) neurons 3 4 11 Days in culture ES cells Neural precursors (sox-1+) Neural cells (most TH+) sox-1

30 neurons ES cells tuJ 3 4 11 Days in culture Neural cells (most TH+)
stromal fixed-feeders (- serum) neurons 3 4 11 Days in culture ES cells Neural cells (most TH+) NeuF Nestin tuJ

31 K18 neurons ES cells BMP-4 Neural cells (NeuN, NeuroF
mesenchymal fixed-feeders (- serum) neurons 3 5 11 Days in culture ES cells Neural cells (NeuN, NeuroF Nestin, b-III tubulin)

32 K14 K18 neurons ES cells serum BMP-4 Neural cells (NeuN, NeuroF
mesenchymal fixed-feeders (- serum) neurons 3 4 11 Days in culture ES cells Neural cells (NeuN, NeuroF Nestin, b-III tubulin)

33 (dommage mitochondrial)
Contrôle BMP-4 Iodure de Propidium contrôle DIOC6 (dommage mitochondrial) apoptotic cells living cells dead cells DIOC6: retains in intact cells excluded in apoptotic cells Iodure de Propidium: excluded in living cells retains in death cells We observed soon after BMP-4 treatment that a large fraction of the committed ES cels dies by apoptosis, as demonstrated by increased mitochondrial mbne permeabilisation and activation of caspase- 3.

34 (dommage mitochondrial)
BMP-4 induit l’apoptose des cellules ES Gambaro et al. (2006) Cell Death Diff 9 16 6 8 Iodure de Propidium apoptose spontanée apoptose induite 12 73 58 18 We observed soon after BMP-4 treatment that a large fraction of the committed ES cels dies by apoptosis, as demonstrated by increased mitochondrial mbne permeabilisation and activation of caspase- 3. contrôle BMP-4 Caspase-3 clivée - + BMP-4 Procaspase-3 ß-tubuline DIOC6 (dommage mitochondrial)

35 - + - + BMP-4 Apoptosis Smad 1 p38 MK BMP-4 R BMP-4
TAK 1 (MAPKKK) p38 MK Apoptosis Caspase-3 clivée ß-tubuline BMP-4 Procaspase-3 contrôle % de cellules vivantes 20 25 30 35 40 45 50 55 Milieu 1µM 3µM 10µM Contrôle PD169316 PD169316 We then demonstrated that this BMP-4 apoptosis of ES cells occurs through the Smad pathway since Smad 6, the natural repressor of the Smad pathway, prevents apoptosis induced by BMP-4. Inh of p38MK has not effect.

36 BMP-4 induit l’apoptose des ES cells via la voie des Smad
Flag-Smad-6 Β-gal BMP-4 Cleaved Caspase-3 Procaspase-3 ß-tubulin β -galactosidase flag 20 25 30 35 40 45 50 55 contrôle AdV- smad-6 % de cellules vivantes AdV- LacZ no BMP-4 BMP-4 BMP-4 R Smad 1 TAK 1 (MAPKKK) p38 MK Apoptosis GS box P P P Type II Type I Smad 6 P Smad-4 Smad-1, 5, 8 We then demonstrated that this BMP-4 apoptosis of ES cells occurs through the Smad pathway since Smad 6, the natural repressor of the Smad pathway, prevents apoptosis induced by BMP-4. Inh of p38MK has not effect. P Smad-1, 5, 8 Smad-4 P +/- R-Smad Smad4 Gènes cibles: msx-1 et msx-2

37 _ + BMP-4 - + - + 3 10 4 Jours en culture 2
Sox-1 Jours en culture ES sur feeders 2 b-III tubuline, NeuN, Nestine, NeuF b-III tubuline % de cellules Neurofilament positives Adv Smad6 LacZ 5 10 15 20 25 30 Contrôle _ + BMP-4 Nb absolu de cellules (x 10-4) 20 16 12 8 4 Sox1- Sox1+ + Ad-Smad6 BMP In the course of neural diferentiation, we identified the first appearance of Sox1+ cells, which are neural precurors and the neural specifi markers appear later, at about day 5. Interestingly, we demonstrated that the sox1+ cells, which represent about 70%

38 BMP-4 induit l’apoptose des précurseurs neuronaux sox-1+
Caspase-3 clivée co-marquage NO BMP-4

39 cellules ectodermales
BMP-4 induit l’apoptose des progéniteurs neuronaux issus de cellules ES K14 + serum Gambaro et al. (2006) Cell Death Diff précurseur neuroectodermal ? cellules ectodermales (K8/K18) sox-1- ES Committed neural precursor sox-1+ BMP - 4 neurones (NeuN, NeuroF Nestine, b-III tubuline) Smad apoptosis of neural sox-1+ precursors

40 neurons DNp63 is activated during BMP-4-induced ES cell commitment
mesenchymal fixed-feeders (- serum) neurons 3 4 11 Days in culture ES cells BMP transcriptome analysis +/- BMP-4:

41 TAp63 DNp63 proapoptotic cell proliferation cell adhesion
p63 belongs to the p53 gene family (1979) (1998) p53 p63 p73 TAp63 DNp63 proapoptotic cell proliferation cell adhesion p21, Notch lama3, Itgb4, Perp cellular senescence genomic stability (SKPs)

42 p63-related ectodermal dysplasia syndromes Cleft lip and/or palate
ectrodactyly (Celli J. et al. Cell 1999) ectodermal dysplasia Cleft lip/palate Ankyblepharon p63-related ectodermal dysplasia syndromes Ectodermal Dysplasia Cleft lip and/or palate Limb defect EEC AEC ADULT SHFM

43 (Mills, Nature 1999; Yang, Nature 1999)
p63 is required for normal ectodermal development (Mills, Nature 1999; Yang, Nature 1999) p63-/- p63 WT No stratified epithelia: skin remains single ectodermal layer. p63 WT p63-/- p63-/- p63 WT No limbs: no AER (apical ectodermal ridge) formation and cranio-facial defects What is the function and regulation of p63 during development and in pathology ?

44 X p63 is not necessary for ectodermal commitment
BMP4 + serum K14 / ∆Np63 X 40 p63 is not necessary for ectodermal commitment but may be required for epidermal fate epidermal cells (K5/K14) serum no BMP4 K18 / ∆Np63 ectodermal cells (K8/K18) BMP-4 ES X neural cells

45 X DNp63 is required for epidermal differentiation of ES cells
BMP-4 ectodermal cells (K8/K18) epidermal cells (K5/K14) neural cells serum sh-p63 X sh-DNp63: sh-pSuper: tub ES wt ES pSuper ctrl P63-1 P63-2 P63-3 ∆Np63 - +

46 DNp63a is necessary to induce epidermal differentiation
of ES-derived ectodermal cells DNp63 K14 merge DNp63a Target genes KGF-R miR 125 BMP miR 328 Notch miR IKKa miR 720 PERP …… ITGB4 ITGA6 Lamc2 U3 ligase,…. ECM BMP-4 ES cells Ectodermal progenitors TAp63

47 New function for p63 during embryonic development ?

48 Could p63 replace BMP-4 to induce epidermal fate?
cells (K5/K14) ? p63 fixed stromal feeders (- serum) ectodermal progenitors (K8/K18) 3 5 11 Days in culture ES cells

49 p63 cannot replace BMP-4 to induce epidermal fate
Link to cardiogenesis? epidermal cells (K5/K14) p63 fixed stromal feeders (- serum) ectodermal progenitors (K8/K18) 3 5 11 Days in culture ES cells

50 The cardiac developmental pathways
Pluripotent state Primitive streak (mesendoderm) Endoderm Sox-17 Tbx5 Islet Tbx1 Nkx2.5 Mef2c First Heart Field Second Heart Field Anterior splanchnic mesoderm Pharyangeal Left ventricle Atrial Right ventricle OFT Cardiac crescent Mesoderm Brachyury, Fgf8 Cardiac mesoderm Mesp-1

51 TAp63 is required for in vitro cardiogenesis
sh ctrl p63 si DNp63 TAp63 Alain Medawar, Matthieu Rouleau

52 D D D Which cells are producing p63? Multipotent Cardiac Cardiac cells
Cardiovascular progenitors (Mesp1/2, sox-7+, Flk1) Cardiac progenitors (Nkx2.5,Tbx5, Mef2c,Isl1) Cardiac cells (TpnT, a-actinin) TnT2 * Day 12 101 102 103 Mlc2v a-actinin ** Nkx2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Day 5 Day 11 Tbx5 10 20 30 40 50 60 Islet1 80 120 sh-ctrl sh-p63 Mesp1 60 80 100 Day 2 Day 5 10 20 40 Brachyury 8 12 2 4 6 Fold Induction / ctrl day 0 Primitive Mesoderm (Brachyury T) Primitive streak (EMT) Epiblast Which cells are producing p63? sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin D sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin D sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin D sh-ctrl sh-p63 sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin sh-ctrl sh-p63 sh-ctrl sh-p63 MLC2v α-actinin

53 (primitive and/or extra-embryonic) Sox17 p63 Merge Epiblast
Multipotent Cardiovascular progenitors (Mesp1/2, sox-7+, Flk1) Cardiac progenitors (Nkx2.5,Tbx5, Mef2c,Isl1) Cardiac cells (TpnT, a-actinin) Primitive Mesoderm (Brachyury T) Primitive streak (EMT) Endoderm (sox-17+) (primitive and/or extra-embryonic) Sox17 p63 Merge Epiblast Alain Medawar

54 (primitive and/or extra-embryonic)
Multipotent Cardiovascular progenitors (Mesp1/2, sox-7+, Flk1) Cardiac progenitors (Nkx2.5,Tbx5, Mef2c,Isl1) Cardiac cells (TpnT, a-actinin) E7.5 Marja L Mikkola, Stockholm) Primitive Mesoderm (Brachyury T) Primitive streak (EMT) Sox17 p63 Merge Epiblast Endoderm (sox-17+) (primitive and/or extra-embryonic) Alain Medawar

55 % of TnT2+ cells (among GFP+ cells)
Cell non-autonomous effect of p63 on cardiogenesis Beating cells +++ +/- 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 sh-ctrl % of TnT2+ cells (among GFP+ cells) sh-p63-gfp WT ES GFP-shp63 ES Matthieu Rouleau

56 % of TnT2+ cells (among GFP+ cells)
Non-cell autonomous effect of p63 on cardiogenesis Beating cells % of TnT2+ cells (among GFP+ cells) 20 18 WT ES +++ 16 - + sh-ctrl cells * 14 12 GFP-shp63 ES +/- 10 8 6 4 ++ 2 Mixed ES Among GFP+ cells sh-p63-gfp sh-ctrl Matthieu Rouleau

57 Cardiac rescue by exogenous Activin-A
Alain Medawar, Matthieu Rouleau

58 Cardiac rescue by ectopic GATA6
% beating/EBs day of differentiation shp63 shp63 + GATA6 WT ES cells WT shp63 shp63-GATA Matthieu Rouleau, Michel Pucéat

59 (Yang, Nature 1999; Mills, Nature 1999)
? p63 KO mice (Yang, Nature 1999; Mills, Nature 1999) During embryogenesis, the skin derives from both ectoderm and mesoderm………………… However, to define more precisely their specific functions and rto identify the molecular mechanisms involved, we decided to evaluate the potential of ES cells to recapitulate in vitro the main steps of normal and pathological skin development. Matthieu Rouleau, Alain Medawar

60 M M wild type newborn heart tissue p63-/- newborn heart tissue
Myofibrillar fragmentation and disorganization. Mitochondria were randomly distributed, large and swollen Intracellular Ca2+ transient in embryonic hearts (E10.5) Fluo-4 fluorescence F-F0/F0 - 5 10 15 20 2min wild type p63 -/- -2 2 4 6 8 Michel Puceat (Evry) Mitochondria were randomly distributed, large and swollen. These defects preceded any evidence of chamber dilation and were equally apparent in right and left ventricular chambers.

61 Could p63-related ED patients suffer from unexpected heart defect?
Patient 1 with a systolic murmur Patient 3 with an atrial septal defect Rinne T. et al. (2008) Human Mol Genet. 17: : TAp63 From H. Van BOKHOVEN DNp63

62 The cardiac developmental pathways
Pluripotent state Sox-17, activin-A, GATA4/6 Wnt,...? TAp63 Primitive streak (mesendoderm) Endoderm Sox-17 Cardiac crescent Left ventricle Atrial First Heart Field Mesoderm Tbx5 Brachyury, Fgf8 Anterior splanchnic mesoderm Nkx2.5 Mef2c Cardiac mesoderm Mesp-1 Islet Tbx1 Pharyangeal mesoderm Right ventricle OFT Second Heart Field

63 The cardiac developmental pathways
Pluripotent state Sox-17, activin-A, GATA4/6 Wnt,...? TAp63 Primitive streak (mesendoderm) Endoderm Sox-17 Cardiac crescent Left ventricle Atrial First Heart Field Mesoderm Tbx5 Brachyury, Fgf8 Anterior splanchnic mesoderm Nkx2.5 Mef2c Cardiac mesoderm Mesp-1 Islet Tbx1 Pharyangeal mesoderm Right ventricle OFT Second Heart Field