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Définition de la Biotechnologie Lutilisation dorganismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou denzymes cellulaires pour fabriquer un produit.

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1 Définition de la Biotechnologie Lutilisation dorganismes, de cultures tissulaires, de cellules vivantes ou denzymes cellulaires pour fabriquer un produit défini.

2 Source: Evens, R. P., Witcher, M., Therapeutic Drug Monitoring 1993; 15: Biothérapie Définition :Utilisation des produits de biotechnologie pour le diagnostic ou le traitement des maladies –Corriger les déficits de substances endogènes –Stimuler les processus physiologiques naturels –Bloquer les protéines ou les acides nucléiques non fonctionnels

3 1953 Découverte de la structure de lADN 7375 Production danticorps monoclonaux 82 Approbation de linsuline recombinante 61–65 Identification du code génétique AT C T A T C T G G A G T G T G A A C C 77 Introduction de la PCR 86 Produits biologiques approuvés pour lutilisation clinique Fin des années 80 et 90 Petites molécules Chimie combinatoire Génomique Thérapie génique Clonage dun gène humain CTAGGC GTAAT TGCTA Evolution de la Biotechnologie Clonage de lADN

4 MédicalRechercheAgricultureEnvironnementIndustrie Impact de la Biotechnologie sur la société

5 1 Cellule humaine et noyau Chromosomes –23 maternels, 23 paternels –Femmes : XX –Hommes : XY 46 3 MILLIARDS de paires de nucléotides à gènes Chromosomes, Gènes, ADN

6 Le principe fondamental : LADN fabrique lARN qui synthétise la protéine

7 UUUPheUCUSer UUCPheUCCSer UUALeuUCASer UUGLeuUCGSer CUULeuCCUPro CUCLeuCCCPro CUALeuCCAPro CUGLeuCCGPro AUUIleACUThr AUCIleACCThr AUAIleACAThr AUGMetACGThr GUUValGCUAla GUCValGCCAla GUAValGCAAla GUGValGCGAla UAUTyrUGUCys UACTyrUGCCys UAAStopUGAStop UAGStopUGGTrp CAUHisCGUArg CACHisCGCArg CAAGlnCGAArg CAGGlnCGGArg AAUAsnAGUSer AACAsnAGCSer AAALysAGAArg AAGLysAGGArg GAUAspGGU Gly GACAspGGCGly GAAGluGGA Gly GAGGluGGG Gly ARNmTRADUCTIONProtéine Le code génétique A U C G A U A G A U A C G U A G C IIe Arg IIe Arg Gly Asn Asp

8 Gène sur le chromosome (ADN) Chromosome ARNm pré-ARNm Protéine Transcription Traduction Séquence de tête Intron 1 Exon 3 Exon 2 Exon 1 Intron 2 Splicéosome Séquence de terminaison Introns et Exons dans la transcription des gènes

9 Principales techniques de la Biotechnologie Technologie de lADN recombinant Anticorps monoclonaux Blocage des nucléotides (anti-sens) Thérapie génique Amplification en chaîne par polymérase PCR Chimie combinatoire Modelage moléculaire Chimie des hydrates de carbone Génomique Chimie des petites molécules

10 1. Isolement 2. Clonage3. Production du gène et expression de protéines Plasmide Clones Enzymes de restriction Milieux de culture Ligase Fermenteur Promoteur/amplificateur Flacons cylindriques Lieur (DNA linker) Chromatographe Cellule hôte Outils de la technologie de lADN recombinant Gène Transcriptase inverse Polymérase Sonde dADN

11 Site de coupure par lenzyme Escherichia coli Haemophilus aegyptius Thermus aquaticus Desulfovibrio desulfuricans Providencia stuarti Microcoleus stuarti Origine de lenzyme EcoRI Hae III Tag I Dde I Pst I Mst II Nom de lenzymeEx. de digestion par EcoRI G C A T A T T A T A C G G C G C CC GG T A C G GA CT C G T A NA NT G C C G C G TN AN A T G C G CTGCAG GACGTC Endonucléases de restriction : Des enzymes qui coupent lADN au niveau de sites spécifiques GCTTA A G CTTAA Eco RI

12 Pst I EcoRI Hind II Sma II Polylieur Site de clonage Opérateur Promoteur Origine Résistance à lampicilline Plasmides : Vecteurs pour le clonage et lexpression des gènes Bam HI Résistance à la tétracycline

13 Transcriptase inverse Bibliothèque génomique Séquençage des acides aminés Gène souhaité Protéine ARNm Sonde dADN ADN Option 1 Option 2 Option 3 Synthèse de lADN Etape 1 : Isolement du gène

14 Plasmides Enzymes de restriction Amplificateur/promoteur Protéine souhaitée ADN ligase 1. Gène souhaité incorporé dans le vecteur 2.Transfert du vecteur dans la cellule-hôte Lien dADN Gène 3.Clonage/expression de la protéine souhaitée Etape 2 : Clonage et Expression

15 Inoculat Culture cellulaire Purification Formulation Galénique Banque cellulaire Flacon en T Flacon agitateur Fermenteur Flacons cylindriques dinoculat Flacon cylindrique Phase de croissance Changement de milieu Cycle 1 de production Changement de milieuRécolte 2 Cycle 2 de production Récolte 1 Concentration/diafiltrationProtéine brute en vrac Chromatographie sur colonneProtéine brute décongeléeFiltration stérile Protéine purifiée en vrac Ampoules prêtes à lemploi Protéine purifiée en vrac Tampon et stabilisateurs Etape 3 : Production de protéine Cellules de Mammifère

16 Banque cellulaire Flacon en T Flacon agitateur Fermenteur Inoculat Changement de milieu Cycle 1 de production Cycle 2 de production Changement de milieu Centrifugation Pâte cellulaire brute en vrac Pâte cellulaire brute en vrac Chromatographie sur colonne Filtration stérile Protéine purifiée en vrac Protéine purifiée en vrac Tampon et stabilisateurs Ampoules prêtes à lemploi Inoculat Culture cellulaire Purification Formulation Galénique Destruction des cellules Destruction Des vacuoles Etape 3 : Production de protéine Souche microbienne

17 Banque cellulaire Flacon en T Flacon agitateur Fermenteur Flacons cylindriques dinoculat Etape 3a : Inoculation

18 Flacon cylindrique Phase de croissance Changement de milieu Cycle 1 de production Changement de milieuRécolte 2 Cycle 2 de production Récolte 1 Concentration/diafiltration Protéine brute en vrac Etape 3b : Culture cellulaire

19 Chromatographie sur colonne Protéine brute décongelée Filtration stérile Protéine purifiée en vrac Etape 3c : Purification

20 Ampoules prêtes à lemploi Protéine purifiée en vrac Tampon et stabilisateurs Etape 3d : Formulation

21 8+ tests Par exemple : Caryotype, criblage dinfectiosité/ oncogénicité, stabilité du gène 20+ tests Par exemple : Séquence Amino-acide, cartes de peptide, CLHP, SDS-PAGE, dosage radio- immunologique,dosagesbiologiques 10+ tests Par exemple : Recherche dendotoxine, provocation par protéine, rendement en protéine 30+ tests Par exemple : Analyse réitérée de la protéine, pureté, contamination de lADN, tests de stabilité : Plasmides et cellules-hôtes Produit en vrac Validation du processus Lots de produit final Etape 4: Contrôle qualité – congélation – chauffage – dénaturation – pH

22 1.Souris immunisée contre lantigène dintérêt 2.Cellules B productrices danticorps extraites de la rate 3.Cellules B fusionnées avec les cellules myélomateuses (hybridome) 4.Sélection des hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux 5.Culture du meilleur hybridome 6. Récolte et purification des anticorps monoclonaux Cellules myléomateuses Technologie des anticorps monoclonaux

23 Corriger un déficit héréditaire Corriger un déficit génique acquis Programmer une cellule pour exprimer de nouvelles propriétés Objectifs Lymphocytes Fibroblastes Cellules endothéliales Kératinocytes Hépatocytes Myocytes Epithélium bronchique Cellules-souches médullaires Cellules cibles Thérapie Génique

24 Maladie de Gaucher, obésité, neuropathie de Charcot-Marie-Tooth Cancer familial du côlon, stérilité Rétinite pigmentaire, syndrome de von Hippel-Lindau Maladie de Huntington Polypose colique familiale Hémochromatose, ataxie spino-cérébelleuse, bec de lièvre et fente palatine Exostoses multiples, syndrome de Werner, Syndrome de Langer-Gideon Mucoviscidose, syndrome de Williams Mélanome malin, ataxie de Friedriech Néoplasie endocrinienne multiple de type 2 Anémie falciforme, syndrome du QT long Phénylcétonurie, diabète de type 2, syndrome de Stickler Rétinoblastome, BRCA2, syndrome de Wilson Dystrophie musculaire, adrénoleucodystrophie, hémophilie, syndrome de Barth Neurofibromatose de type 2 Syndrome de Down, sclérose latérale amyotrophique, maladie dAlzheimer Déficit en ADA, syndrome dAlagille Hypercholestérolémie familiale, dystrophie myotonique, BCL3 Amyloïdose, groupe sanguin kidd Polykystose rénale, BRCA1 Polykystose rénale, fièvre méditerranéenne familiale Maladie de Tay-Sachs, xeroderma pigmentosum Maladie dAlzheimer, porphyria variegata X Y Cibles de la thérapie génique

25 Objectifs Créer une carte physique Séquencer toutes les paires de base Créer des informations, des outils, des forums et des formations Marqueurs Clones...ACGTAATTCATGCCCCGG... Créer une carte génétique Projet du génome humain

26 Cibles potentielles : Virus Cancers Maladies auto-immunes Mécanisme en présence de virus ou doncogènes : Anti-sens biologique (anti-ARNm) ARNm cible (filament sens) La liaison complémentaire bloque la traduction de lARNm protéines responsables de pathologies non synthétisées Vecteur (virus ou lipide) Blocage des nucléotides : Thérapie anti-sens

27 1.Récolte dovocytes fertilisés de souris 2.Gènes du cancer du sein isolés, copiés, injectés dans les ovocytes 3.Ovocytes contenant les gènes du cancer transplantés chez la mère 4.Environ un tiers de la portée est transgénique, avec présence des gènes du cancer dans toutes les cellules Source: Biotechnology for the 21st Century, Souris transgénique Créer des animaux transgéniques comme modèles de maladies

28 DéveloppementHoméostase Activation inappropriée Inhibition inappropriée Rôles physiologiques Rôles pathologiques dans le membre foetaldans la division rapide des leucocytes dans la maladie dAlzheimer dans linfection virale expression des gènes anti-apoptose mutation ßêta-amyloïde sensibilité aux toxines bone marrow Apoptose * Bone marrow : Moelle osseuse Moelle osseuse

29 Senescence Adapted from Science, Sénescence cellulaire, télomères et vieillissement Sénescence Télomères Cellules cancéreuses Télomérase Maladie du viellissement Immortalité cellulaire Ajoute des télomères Cellules somatiques normales

30 Facteurs de croissance hématopoïétiques Cellule souche pluripotente Blaste CFU Ligand flk-2/flt-3 SCF CFU-GEMM Cellule souche lymphoïde Précurseur NK SCF SCF IL-3 Ligand flk-2/flt-3 MGDF/TPO MGDF/TPOSCFIL-3 SCF SCFIL-3 IL-3 IL-3 IL-3 Ligand flk-2/flt-3 Ligand flk-2/flt-3IL-7 SCF SCF Ligand flk-2/flt-3 IL-7 IL-3 GM-CSF G-CSF SCF SCFIL-3GM-CSFIL-11IL-6MGDF/TPO IL-3GM-CSFEPO IL-3GM-CSF BFU-ECFU-MegCFU-GMCFU-EoCFU-BaCFU-Mastocyte Cellule pré-B Cellule pré-T CFU-E Mégacaryocyte CFU-GCFU-M Proplaquettes Plaquettes Réticulocyte Hématie IL-3GM-CSFEPO BasophileMacrophage Cellule NK Plasmocyte IL-3 GM-CSF G-CSFIL-3GM-CSFM-CSF IL-7 IL-3 IL-3 SCF IL-6IL-2IL-7SCFIL-2 Lymphocyte B Lymphocyte T NeutrophileEosinophile Mastocyte tissulaire GM-CSFM-CSF Monocyte

31 Augmentent la masse et la force musculaires Comment les neurotrophines pourraient Comment les neurotrophines pourraient agir dans les maladies du neurone moteur Neuropathie périphérique Neurones sensoriels Neurones sympathiques Neurones parasympathiques Sclérose latérale amyotrophique (SLA) Neurones moteurs Maladie d'Alzheimer Neurones cholinergiques du cerveau antérieur Neurones néocorticaux Maladie de Parkinson Neurones dopaminergiques NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5 NGF, FGF-2 CNTF CNTF, BDNF, NT-4/5, IGF-1, GDNF Relations avec les troubles neurologiques Favorisent la survie des neurones moteurs Favorisent la régénération axonale Induisent le bourgeonnement des plaques terminales motrices 3 Barrière hémato-méningée Récepteurs spécifiques Actions spécifiques NGF BDNF, NT-3, NT-4/5 GDNF, BDNF, NT-4/5, FGF-1, FGF-2, IGF-1 Facteurs Neurotrophiques BDNFNT-3 TrkBTrkC Membrane cellulaire

32 Développement dun vaccin classique Développement dun vaccin recombinant Clonage du gène de lantigène viral dans une cellule de levure Antigène viral non-infectieux Pool de plasma humain Purification Inactivation Purification Vecteurs viraux Maladies infectieuses VIH, HSV, CMV, hépatite B, grippe, rotavirus, coqueluche, maladie de Lyme, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis Cancer Mélanome, sein, côlon, ovaire, col utérin, prostate Sclérose en plaques Polyarthrite rhumatoïde PsoriasisContraception Vaccins à base dADN recombinant En cours de développement Vaccin recombinants Comment sont-ils fabriqués ?

33 Problèmes pratiques concernant la manipulation des matériaux biologiques Conservation –réfrigération habituellement nécessaire –la congélation/décongélation et la chaleur peuvent dénaturer la protéine Stérilité –absence habituelle dagent de conservation Préparation –une agitation excessive pendant la reconstitution peut dénaturer la protéine –lutilisation dun diluant approprié est essentielle –peuvent adhérer au plastique ou au verre –calculs des doses basés sur les unités dactivité vs les unités pondérales (micro grammes) –administration habituellement parentérale (SC ou IV) Problèmes concernant ladministration à domicile –Transport –Conservation –Auto-administration –Formation du patient


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