La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Microscopies optiques appliquées à la biologie Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Microscopies optiques appliquées à la biologie Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure."— Transcription de la présentation:

1 Microscopies optiques appliquées à la biologie Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

2 Plan du cours 1.Introduction 2.Le microscope comme instrument optique 3.Méthodes de contraste en transmission Fond clair Contraste de Phase Contraste interférentiel 4. Microscopie de fluorescence 5. Microscopie non-linéaire

3 Quest ce quun microscope? Instrument qui: - donne une image grossie dun petit objet (grossisement) - sépare les détails de celui-ci sur limage (résolution) - rend les détails visibles à lœil ou avec une caméra Microscopie : Introduction

4

5 Source de lumière Agents de contraste OptiqueDétecteur Laser Lampe UV … Absorbants Diffusants Dépolarisants Fluorescents … Objectifs Lentilles … Caméras Photodiodes …

6 Formation des images dans un microscope avec objectif corrigé à linfini Schéma simplifié Loculaire travaille sur cette image comme le ferait une loupe : grossissement g 2 =D/f oculaire D : Distance conventionnelle (25cm, distance minimale de vision distincte) f tube : en général 160 mm Lobjectif et une lentille de tube forment un système afocal => grossissement g 1 = f tube /f obj Limage intermédiaire est au voisinage du plan focal objet de loculaire

7 Grossissement du microscope G = g 1.g 2 Objectifs. Grandissements g 1 faibles (2,5 à 10), moyen (15 à 25), ou fort (>40), en général les objectifs 60x et 100x sont à immersion. Oculaires. Grossissements normalisés g 2 : 6.3x, 10x, 16x, 25x B. Grossissements

8 Les Objectifs de Microscope Élément le plus important du microscope, détermine la qualité de limage quon peut obtenir (forme limage primaire)

9 Aberrations optiques aberrations chromatiques aberrations sphériques aberration de coma astigmatismes courbure de champ

10 III. Aberrations des lentilles A. Aberration chromatique Focale f vérifie 1/f = (n-1)(1/R 1 -1/R 2 ) lindice n dépend de la longueur donde de la lumière qui traverse le verre => f dépend de ! Pour une lentille convergente : Pour une lentille divergente, foyer bleu et rouge inversés… Correction : association de deux lentilles, une lentille convergente (Crown) et une lentille divergente (Flint) : achromat, ou doublet achromatique.

11 B. Aberration sphérique Lentilles simples : un ou plusieurs dioptres sphériques.Les rayons lumineux qui passent à la périphérie ne convergent pas au même endroit que les rayons qui passent au voisinage de laxe limage dun point source nest pas un point, mais une tâche définie comme le « cercle de moindre confusion ». Correction des aberrations sphériques : limitation des bords des lentilles (diaphragme douverture), lentilles non sphériques (difficiles à usiner, peu usitées) association de lentilles de courbures différentes (doublet, triplet). Conséquences : diminution du contraste et de la résolution (image floue)

12 Corrections : lentille perpendiculaire à laxe, lentille diaphragmée, association de lentilles. C. Aberration de coma Image dun point hors axe optique apparaît comme une comète. Sobserve lorsque la lentille nest pas perpendiculaire à laxe optique.

13 D. Astigmatisme Image dun point hors axe apparaît comme un bâtonnet; deux foyers dus à lasymétrie du montage. Corrections : lentille diaphragmée, association de lentilles.

14 E. Courbure de champ Limage dun plan nest pas un plan, mais une surface sphérique concave (lentille convergente) ou convexe (lentille divergente). Correction : association de deux lentilles. Conclusion. Toutes ces aberrations peuvent être corrigées par association de lentilles et/ou traitement des surfaces : objectifs de microscope compliqués, fragiles et coûteux.

15 Objective Type Spherical Aberration Chromatic Aberration Field Curvature Achromat1 Color 546nm 2 Colors 486&656 nm No Plan Achromat1 Color2 ColorsYes Fluorite Semi-apochromat 2-3 Colors No Plan Fluorite3-4 Colors2-4 ColorsYes Plan Apochromat 3-4 Colors4-5 ColorsYes

16 Résolution latérale et axiale

17 Résolution latérale A. Ouverture numérique, résolution Définition : O.N. = n sin Tache de diffraction r = 1.22 f /D Puisque sin = D/2f, r = 0.61 /O.N.

18 Résolution spatiale Pour un bon objectif: NA = 1.4, R = 250 nm

19 PSF expérimentale Fonction dAiry Gaussienne

20 Augmenter la résolution : augmenter lindice n : objectifs à immersion (eau n=1.33, huile n=1.55) augmenter, en construisant des objectifs à focale très courte, que lon approche très près Ouverture maximale : N.A. = 1.4, grossissement x100, objectif immersion huile Pour une longueur donde de 500 nm, r = 214 nm. Limite de séparation de lœil humain : 100 m, soit un gain de 500. Récemment, N.A. = 1.45 (grossissement x60, immersion huile) Pour la microscopie de fluorescence en onde évanescente : N.A. = 1.4, n=1.55, = 64.6° N.A. = 1.45, n=1.55, = 69.3° Réflexion totale interface verre/eau = 62.5°

21 Objective Type Plan AchromatPlan FluoritePlan Apochromat MagnificationN.A Resolution (µm) N.A Resolution (µm) N.A Resolution (µm) 4x x x x x x N.A. = Numerical Aperture

22 B. Profondeur de champ Distance entre le point le plus haut et le point le plus bas de la préparation qui donne une image nette. Cest donc lépaisseur de la tranche despace dans laquelle tous les points de lobjet donnent une image nette. Elle dépend de louverture numérique : la profondeur de champ diminue lorsque louverture numérique augmente. Exemples : 25 m à lobjectif x10 1 m à lobjectif x100 à immersion

23

24 Méthodes de contraste optique fond clair contraste de phase contraste interférentiel (aussi appelé Nomarski)

25 A.Formation des images en fond clair : Interprétation en termes dinterférences Un objet atténue la lumière le traversant : E = t E 0 cos( t –kz) avec 0

26 Imagerie dobjets de phase (objets transparents: cellules et microorganismes) Transforme des petits déphasages en variation damplitude II. Microscopie à contraste de phase Échantillons minces non colorés sont transparents en fond clair. Pourtant : suivant structure traversée par la lumière, différence de phase différentes… MAIS lœil et les détecteurs ne sont sensibles quaux changements dintensité ou de couleur… Pendant longtemps : fixations-colorations abîment les cellules, contraste de phase les respecte

27 Les objets transparents (cellules et microorganismes,.. ) induisent un déphasage du champ électrique (en première approximation : pas dabsorption) = 2 (n o -n e ) e/ e épaisseur, (n o -n e ) différence dindice faible : n e = 1.36, n 0 = 1.335, e =1 m, = /10 Après lobjet : E = E 0 cos( t –kz + ) Interprétation en termes dinterférences : E = E 0 cos( t –kz) cos E 0 sin( t –kz ) sin E 0 cos( t –kz) E 0 sin( t –kz ) sin A.Formation des images en contraste de phase : Lamplitude ne varie pas… comment transformer cette variation de phase en variation damplitude ?

28 Ajouter un déphasage de /2 (ou – /2) au champ non perturbé : E = E 0 sin( t –kz) E 0 sin( t –kz ) sin sin sin( t –kz ) E = -E 0 sin( t –kz) E 0 sin( t –kz ) sin sin sin( t –kz ) Application : observation de cellules vivantes en culture, sans traitement de fixation/coloration

29 En pratique : condenseur à diaphragme annulaire : cône de lumière « directe » qui passe ensuite à travers un objectif à anneau de phase (déphasage /2 et atténuation de 60 à 90%) Fond noir : contours OK, mais structure interne peu révélée. Passage de lun à lautre très utilisé. Existence dun halo clair autour des détails sombres, sombre autour des détails clairs… observation des contours gênée et précision des mesures faible

30

31 Microscopie à Contraste Interférentiel Différentiel: Méthode pour détecter des gradients de phase pour les convertir en variations dintensité Déplacement entre les deux faisceaux inférieur au disque dAiry

32

33

34

35 Microscopie en fond noir Les rayons provenant du condenseur ne pénètrent pas dans lobjectif. Napparaissent que les zones qui diffusent la lumière : contours des objets opaques variations brusques dindice optique Utilisée surtout pour lobservation dobjets dont les structures présentent dimportantes variations dindice et qui, faute de contraste, présentent ne sont pas visibles en fond clair. Élément doptique : condenseur avec diaphragme annulaire : cône de lumière.

36 Microscopie en fond noir Objets plats à structures régulières (diatomées, radiolaires) Formations linéaires (flagelles, fibres, bactéries) Objets punctiformes ou linéaires dont la tailles est < à la limite de séparation détrôné par contraste de phase (sauf quelques cas)

37 Plans conjugués dans le chemin déclairage: - Filament de la lampe - Diaphragme douverture du condenseur* - Plan focal arrière de lobjectif* - plan du point de lœil Plans conjugués dans le chemin de la formation de limage: - Diaphragme de champ - Plan objet (au foyer) - Plan image intermédiaire - Rétine de lœil, ou CCD *Plan où des éléments optiques sont insérés dans les divers techniques de microscopie V. Éclairage de Köhler

38 Condenseur : Léclairage de Köhler permet dobtenir des images de très bonne qualité Éclairement optimisé: - illumination suffisamment intense de lobjet - uniforme sur le champ de vision

39 Une amibe vue sous différentes techniques (à vous de reconnaître)

40 Microscopie de fluorescence

41 Fluorescence Lorsquils sont dans un niveau excité, certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se désexciter en émettant des photons. excitation La longueur donde démission est (souvent) plus grande que plus celle dabsorption et il est possible de sélectionner spectralement la lumière émise microscopie de fluorescence

42 Microscopie de fluorescence Il sagit donc dune détection sur fond noir

43 Système commercial

44 Voir des biomolécules en fluorescence En général, les molécules biologiques (protéines, acides ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, protéines fluorescentes,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans lUV (tryptophane). On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents : couplage covalent (liaison chimique) marquage daffinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient sattacher spécifiquement (anticorps, toxines,…) clonage dune protéine fluorescente

45

46 Sources lumineuses

47 Sources lumineuses pour la microscopie de fluorescence

48 Marqueurs fluorescents: molécules, protéines, nanocristaux

49 Spectres moléculaires : quantification des énergies A. Formation dune molécule diatomique B. Niveaux électroniques, vibration et rotation Molécule stable : il existe un minimum du potentiel dinteraction entre deux atomes Énergie totale E = E e + E v +E r, ces trois énergies sont quantifiées.

50 1)Niveaux électroniques: Niveaux électroniques : niveau fondamental, niveaux excités, transitions entre niveaux (comme dans latome dhydrogène). Transitions possibles dans le visible ou lUV (1 à 10 eV) entre deux niveaux 2)Énergie de vibration : Fond du puits de potentiel : approximation harmonique E n = h (n+1/2) avec 2 = k/m Transitions possibles dans lIR (0.1 eV) entre deux niveaux. 3) Énergie de rotation Spectre de rotation E r = J(J+1) h 2 /8p 2 I I : moment dinertie de la molécule Transitions possibles dans le domaine m-ondes (0.001 eV) entre deux niveaux

51 kT = 0,025 eV : niveaux rotationnels peuplés, mais seul le niveau fondamental électronique et vibrationnel est peuplé.

52 Transitions optiques dans les molécules Recouvrement des fonction dondes des noyaux Déterminé par la symétrie des états électroniques Opérateur dipolaire: Facteur de Franck-Condon :

53 Spectres dabsorption et démission Absorption et émission sont (à peu près) symétriques Il existe un décalage entre les pic dabsorption et démission (décalage de Stokes)

54 Description dun système fluorescent à 2 niveaux |e> |g> T fluo est la durée de vie radiative est la section efficace dabsorption est le coefficient dextinction La molécule peut se désexciter de deux manières différentes : en émettant un photon ou non radiativement.

55 Taux de fluorescence Solution à létat stationnaire:

56 Pour gagner en signal sur bruit, on essaie toujours davoir I << I s Cas limites A faible intensité, régime linéaire : A forte intensité, régime saturée : Efficacité quantique radiative probabilité quun photon absorbé soit réémis

57

58 Etude résolue en temps Si on excite avec un laser pulsé (à la fréquence 1/T rep ): Si on connaît : On peut déterminer k r et k nr

59

60 Absorption Fluorescence

61

62 Nanocristaux semiconducteurs Nanoparticules composées de 100 à atomes of CdSe recouverts par une coquille de ZnS 2-5 nm

63 Du semiconducteur massif à la boite quantique Semiconducteur : matériau cristallin isolant dont la bande interdite (« le gap ») est relativement petite. Les électrons sont soumis au potentiel périodique du réseau cristallin Il existe une structure de bande des niveaux dénergie Dans un semiconducteur, la bande de valence est remplie, la bande de conduction est vide et E gap nest pas très grand.

64 Propriétés optiques de fluorescence Que se passe t-il quand on excite le matériau avec de la lumière ? Des photons de fluorescence sont émis dont lénergie correspond à E gap E gap E > E gap Que se passe t-il lorsquon réduit la taille du matériau ?

65 Des boites quantiques de quelques nanomètres Une particule dans une boite à 1 D : Quels sont les niveaux dénergie des électrons ? V(x) 0L (en fait la boite est tridimensionnelle…) Fonctions propres: Energies propres:

66 Emission et absorption ajustable avec la taille des nanoparticules 2.2 nm CdSe 5.0 nm CdSe absorption Plus les particules sont petites, plus lemission est décalée vers les courtes longueurs donde (grandes énergies) LL

67 Semiconductor Quantum Dots

68

69 Bruit de photon et rapport signal sur bruit

70 Problème de détection: quel est le rapport signal sur bruit ? Signal S de fluorescence Bruit B de variance de moyenne m B et de variance B :

71 Sources de bruit Fluctuations intrinsèques (bruit de photon / shot noise) Signal optique parasite (autofluorescence, lumière diffusée,…) proportionnel à lintensité lumineuse I Bruit électronique (courant dobscurité, bruit de lecture,…) indépendant de lintensité lumineuse

72 Bruit de photon On considère un flux où des particules (des photons) arrivent avec un taux k sur un détecteur (une photodiode) Quel est la distribution des temps entre 2 évenements ? Quelle est la probabilité quon ne détecte rien entre 0 et t ? Quelle est la probabilité de détecter N photons durant le temps t ? (distribution de Poisson)

73 Distribution de Poisson Valeur moyenne : Variance :

74 Bruit dorigine lumineuse Bruit de photons des molécules (non saturées): Bruit dû à la lumière parasite :

75 Sources de bruit électronique Bruit noir de lecture : dû au convertisseur analogue-digital Courant dobscurité : du à lapparition de N obs photoélectrons à cause du bruit thermique (proportionnel au temps) Nombre de coups lecture Lumière incidente Crée des photolélectrons

76 Rapport signal sur bruit Cas limite du « shot noise »:

77 Peut-on voir une seule molécule ? expérience à froid (4°K): Moerner 1989, Orrit 1990 expérience à température ambiante : Betzig 1992 expérience sur une molécule biologique : Xie 1998 expérience sur une molécule dans une cellule : 2001

78 Identifier une molécule unique Pour un fluorophore : photodestruction instantanée Pour un nanocristal : scintillement

79 Tableau comparatif TaillePhotostabilitéAbsorption Cy31 nm~ 5 s = 10 5 GFP2-4 nm~ ms = 10 4 QD10-30 nm> 20 mn = 10 6

80 Microscopie et imagerie de fluorescence microscopie en épifluorescence microscopie confocale microscopie en onde évanescente microscopie à deux photons

81 Microscopie en épifluorescence On éclaire léchantillon avec une lumière collimatée. Pour cela, on focalise la lumière dans le plan focal arrière de lobjectif. Lampe UV ou Laser CCD Camera

82 Exemple : le cytosquelette dune cellule On voit des zones nettes et des zones plus floues microtubules

83 Problème Dans un échantillon épais, on collecte la lumière de tous les plans de léchantillon profondeur champ Excitation Objet dans le plan focal Objet au dessus du plan focal Objet en dessous du plan focal Détection Comment se débarasser de la lumière provenant des plans hors focus ?

84 Microscopie confocale

85 Microscopie en balayage Laser Photodiode, PM Trou de filtrage Objectif On déplace le point de focalisation sur léchantillon.

86 Inconvénient : le temps passé sur un petit objet est bref Taille de limage : N p *N p pixels - Taille de la molécule : N m *N m pixels Fraction du temps passée à exciter la molécule : F = (N m /N p )² Exemple : taille dun pixel : 200 nm, N p = 100, N m = 4, soit F = 0,16 % Si durée totale de limage : 100 ms (10 µs/pixel), cela correspond à 160 µs. NmNm NpNp

87 Exemple Epifluorescence Section confocale

88

89 Neuronal tissue (brain)Drosophila nervous system Mouse kidneyMouse intestine Apotome -

90 Microscopie en onde evanescente

91 Portée de londe évanescente Angle critique :

92 Il faut que lobjectif ait une ouverture numérique supérieure à n 2

93 Vérification expérimentale Sarkar, Atom et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,

94 Exemple epifluorescenceonde évanescente

95 Exemple dapplication : visualisation de lexocytose de vésicules Film en onde evanescente de lexocytose

96 Microscopie non-linéaire

97 MICROSCOPIE A 2 PHOTON Questions : quel est le processus physique de la fluorescence à 2 photons quest ce que la section efficace à 2 photons ? pourquoi faut-il un laser pulsé femtoseconde ? quelle est la résolution spatiale ? quest ce qui limite la profondeur dobservation ?

98 One-photon excitationTwo-photon excitation F IF I 2

99 (resonant) E eg g e diffusion Rayleigh (le ciel est bleu, les couchers de soleil sont rouges…) g e

100 (resonant) E eg g e g e t (Uncertainty principle - Heisenberg) Göppert-Mayer (1 GM = cm 4 s/photon) (non-resonant)

101 Rhodamine : ~ 100 GM GFP : ~ 2 GM (?) Fluorescein : ~ 10 GM QD : ~ GM

102 efficacité quantique radiative F I I Fluorescence

103 T 2-photon enhancement factor T / continu pulsé

104 IpIp T Fluorescence pendant une impulsion Fluorescence moyenne g enhancement factor Intensité moyenne Laser ti:saphire: T 10 ns 100 fs g 10 5

105 Quelle est la fluorescence émise par cette tranche dépaisseur z ?

106 Excitation à 1 photon La fluorescence nest pas confinée en z Excitation à 2 photons La fluorescence est confinée dans le volume dexcitation (PSF 2 photons) Fluorescence dans chaque plan

107 1-photon2-photon

108 PSF z PSF r PSF z = G-L Gaussien 3d Gaussien-Lorentzien (G-L) Résolution

109 Résolution 3D (PSF 2 photons) Mesure avec des billes fluorescentes de 100 nm

110 Facteurs limitants pour la fluorescence Durée de vie ~ 1 ns F max < 10 9 photons/s 10 ns 1 ns F max < 10 8 photons/s maximum 1 photon fluorescence par pulse (taux de répétition laser) 1 fs <<

111 Quelle est la limite en profondeur ? Principalement limitée par la diffusion et labsorption du milieu. photons balistiques : trajectoire rectiligne photons diffusés : le photon dévie de sa trajectoire rectiligne

112 Le nombre de photons balistiques décroît exponentiellement avec la distance P0P0 z P 0 exp(-z / L s ) z max

113

114 NA What is the collection efficiency? works (but…)

115 z0z0 What if sample is scattering?

116 Field-of-view Field stop z0z0 r f.o.v. =135 m Relative collection efficiency ~ (r f.o.v /z 0. ) 2

117 Field-of-view z0z0 r f.o.v. =540 m ×16 Relative collection efficiency ×4

118 La taille du champ de vue est aussi importante que louverture numérique en général, les objectifs de grande ouverture numérique ont un fort grossissement. Cela veut dire que le champ de vue est plus petit. nouveaux objectifs pour la microscopie biphotonique : grande ouverture numérique et faible grossissement Ex: Olympus, x20 et NA~0.95 (rappel : pour un microscope à balayage, la taille de la zone observée nest pas liée au grossissement)

119 Application: imagerie sur des petits animaux Système vasculaire

120 Mouvement dun embryon de drosophile Film des mouvements

121 Imagerie de molécules uniques

122 Résolution spatiale vs Localisation résolution spatiale : déterminée par la précision de pointé du centre de la PSF (réponse impulsionnelle du système optique)

123 Résolution spatiale Pour un bon objectif: NA = 1.4, R = 250 nm

124 PSF expérimentale Yildiz et al., taille du pixel: 86 nm Taille pixel : 216 nm

125 Réponse impulsionnelle Une molécule unique peut être considérée comme une source ponctuelle pour le système optique. La réponse impulsionnelle (la PSF, point spread function) est une fonction dAiry, souvent approximée par une courbe gaussienne 2D. Fonction dAiry Gaussienne NA = 1.45, = 600 nm Rayon dAiry (premier zéro) : Gaussienne 2D : où

126 Localisation La précision du pointé dépend de la capacité à déterminer la position du pic De manière générale, la précision dépend de : nombre de photons collecté N taille a des pixels niveau de bruit b Dans le cas dun signal dominé par le bruit de photons:

127 Explication qualitative On imagine que le point darrivée X i de chaque photon peut être localisé sur le détecteur avec une précision infinie (pixel infiniment petit). On collecte N photons dont la distribution des positions (X i ) correspond à la PSF (de position moyenne m et de largeur. On a un estimateur de la position moyenne.

128 Mouvement dun moteur moléculaire : la myosin V Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization: A. Yildiz et al., Science 300, (2003 ).

129 CY3 Déplacement de la myosin

130 Rotation de la F1ATPase

131 Le moteur tourne avec des pas de 120°

132 Mécanisme de synthèse de lATP Mécanisme de la F0F1ATPase La F0F1 ATPase convertit une différence de potentielle chimique protons pour produire 3 ATP Efficacité du moteur rotatif ~ 100 %


Télécharger ppt "Microscopies optiques appliquées à la biologie Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure."

Présentations similaires


Annonces Google