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Méthodes de recherche et de dénombrement des légionelles dans leau Docteur Cyrille NEYRET Institut Pasteur de la Guadeloupe.

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Présentation au sujet: "Méthodes de recherche et de dénombrement des légionelles dans leau Docteur Cyrille NEYRET Institut Pasteur de la Guadeloupe."— Transcription de la présentation:

1 Méthodes de recherche et de dénombrement des légionelles dans leau Docteur Cyrille NEYRET Institut Pasteur de la Guadeloupe

2 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements (FD T90-522) : –Modalités de prélèvements –Transport des échantillons Méthode par culture (NF T90-431) : –Principe –Interprétations des résultats Méthode moléculaire par PCR (XP T90-471) : –Principe –Avantages –Inconvénients

3 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements AFNOR FD T juillet 2006 : guide applicable aux prélèvements pour la recherche de Legionella sp et L. pneumophila dans les eaux et dans les réseaux deau, dans les eaux dagrément ou de baignade, dans les installations de refroidissement dair par dispersion deau dans un flux dair (IRDEFA) ou tout autre installation à risque.

4 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements Recommandations concernant les modalités de prélèvement et le choix du point de contrôle : 1.Sur un réseau deau : Les points techniques : –sortie de production deau chaude, retour de boucle, vanne de pied de colonne : flamber et faire couler 2 à 3 minutes –partie basse de ballon : faire couler pour chasser les dépôts de la canalisation dévacuation Les points dusage : –Contrôle de lexposition : prélever le 1 er jet, sans flambage –Contrôle des conditions de maîtrise du réseau : prélever après 2 à 3 minutes découlement

5 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements Recommandations concernant les modalités de prélèvement et le choix du point de contrôle : 2.IRDEFA : –Sous la responsabilité de lexploitant (Arrêtés du 13/12/04) –Point du circuit de refroidissement où leau est représentative de celle en circulation dans le circuit, hors influence directe de leau dappoint (à défaut en amont de la dispersion ou dans le bac)

6 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Prélèvements Recommandations pour le transport des échantillons : –Le plus rapidement acheminés au laboratoire : maximum 24h –Enceinte isotherme à 5 3°C (contrôle de la température de lenceinte si délai > 24h) Echantillonnage : –Un litre prélevé dans un flacon stérile –Neutralisation des oxydants (thiosulfate de Na) ou des biocides (si possible)

7 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture Principe : Norme NF T septembre 1993 –Ensemencement direct de léchantillon –Ensemencement dun concentrat obtenu par filtration –Décontamination du concentrat par chauffage, acidification ou les 2, puis ensemencement –Incubation de 8 à 10 jours à 37°C –Mise en évidence des bactéries du genre Legionella –Recherche des Legionella pneumophila

8 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture Aspects des colonies :

9 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture Résultats et commentaires : Limite de quantification : 250 UFC/L RésultatCommentaire < 250 UFC/LLegionella et L. pneumophila non détectées < 250 UFC/LLegionella et/ou L. pneumophila non quantifiables < 500 UFC/LLegionella et L. pneumophila non détectées <500 UFC/LLegionella et/ou L. pneumophila non quantifiables

10 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode par culture En présence dune flore interférente : RésultatCommentaire Ininterprétable Présence dune flore interférente empêchant la détection des Legionella et/ou L. pneumophila < Présence dune flore interférente empêchant la détection des Legionella et/ou L. pneumophila < Présence de Legionella et/ou L. pneumophila non quantifiables en raison dune flore interférente < (< 5 000) Présence dune flore interférente empêchant la détection des Legionella et/ou L. pneumophila < (< 5 000) Présence de Legionella et/ou L. pneumophila non quantifiables en raison dune flore interférente

11 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode moléculaire Principe : Norme XP T avril 2006 –Concentration des échantillons par filtration ou par centrifugation –Lyse, extraction et éventuellement purification de lADN des extraits –Amplification dune ou plusieurs séquences dADN spécifiques du genre Legionella et/ou de lespèce L. pneumophila –Identification et quantification des amplicons en temps réel

12 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode moléculaire Avantages par rapport à la culture : –Délai de réponse

13 Institut Pasteur de la Guadeloupe - 23 novembre 2006 Méthode moléculaire Inconvénients par rapport à la culture : –Non reconnue pour les contrôles réglementaires –Résultats rendus en UG/L (Unité génome) : corrélation avec les UFC/L ? –Inhibiteurs dans le prélèvement –(Lourdeur de mise en œuvre pour les labos)


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