La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

TP 10 Enzymes immobilisées. 1. Préparatifs. La lumière séteint dans la salle de briefing. Un hologramme de la planète géante apparaît. Pour une fois,

Présentations similaires


Présentation au sujet: "TP 10 Enzymes immobilisées. 1. Préparatifs. La lumière séteint dans la salle de briefing. Un hologramme de la planète géante apparaît. Pour une fois,"— Transcription de la présentation:

1 TP 10 Enzymes immobilisées

2 1. Préparatifs. La lumière séteint dans la salle de briefing. Un hologramme de la planète géante apparaît. Pour une fois, hommes et femmes sont réunis ensemble pour écouter lexposé de Ripley.

3 1. Préparatifs. -- On peut y aller ? OK. Maintenant que nous sommes en orbite autour de Jupiter, nous allons pouvoir commencer lexploration directe proprement-dite. Lobjectif étant de ramener sur Terre des échantillons de latmosphère Jovienne et, si possible, mettre en évidence la présence de vie. -- Quest-ce que tu veux quil vive dans cette grosse boule de gaz, demande John narquois. La pression et la température atteignent des valeurs titanesques. -- Des modèles spéculent quil pourrait exister une forme de vie évoluant dans les couches externes. Elle se déplacerait comme des ballons libres ou des dirigeables. -- Elles auraient laspect de gigantesques méduses. -- Cest une blague, surenchérit John ! On nous envoie à la pêche à la méduse ! Cest encore une idée de nana ! -- Les idées de mecs brillent par leur absence, envoie Eva. -- Rappelle-moi, Eva, tu es un mec ou une nana ? -- John, si tu ne te tais pas, gronde Ron, tu finis ton séjour dehors !

4 1. Préparatifs. -- Ripley, explique comment nous allons chercher ces échantillons, intervient Bruce pour calmer les esprits. -- Merci, Bruce. Nous disposons dun drone Jovien. Il est stocké dans la soute depuis notre départ. Bruce et moi sommes en train de finir les simulations. Il est en parfait état de marche. -- Un drone est un appareil automatique, remarque Mélanie. -- Dans notre cas, le drone, appelé Pégase, possède un ordinateur de bord qui lui donne une grande autonomie et des capacités dadaptation aux conditions de vol. Cependant, le vol sera contrôlé à distance, à partir du Junon par un pilote, en loccurrence Bruce ou moi. Descendons à la soute, je vais vous montrer.

5 1. Préparatifs. Bruce se met à la console. Lappareil commence à bourdonner. -- Tout les senseurs sont opérationnels. Pégase est à même de mesurer les paramètres physiques de son environnement. Il contient dans sa carlingue un mini-laboratoire chimique pour établir la composition des gaz de lenveloppe externe. Il sera capable, dans un deuxième temps, de plonger dans la couche hydrogène hélium qui se situe en-dessous de km de profondeur.

6 -- Comment sera-t-il piloté, demande Body ? Ripley se rend près dun caisson vertical posé contre la cloison. Elle louvre comme un sarcophage. -- Voici un « cocon » de pilotage. Le pilote sinstalle à lintérieur et enfile le casque de vision virtuelle. Ripley fait la démonstration. -- Lespace est très confiné et la température sélève rapidement au-dessus de cinquante degré. Cest pourquoi nous sommes deux, Brice et moi, à nous relayer. Les informations de vol sont envoyées par Pégase et traitées par lordinateur avant de nous parvenir au niveau du casque, mais aussi des bras et des jambes qui contrôlent le vol. 1. Préparatifs.

7 -- Mais pour la détection de trace de vie, insiste Mélanie ? -- Ca, cest le domaine dAngie. -- Tu vois la boule sous le nez de lappareil ? Cest le biocapteur. C'est un dispositif permettant de détecter de façon spécifique, une molécule précise et de la doser de façon quantitative. Il est constitué de trois parties: - le biorécepteur, constitué d'une enzyme et de son support - le transducteur, qui transforme le signal chimique en signal électrique - l'amplificateur, qui permet la lecture du signal électrique par l'appareillage. 1. Préparatifs.

8 Plutôt que de tenter de repérer une créature vivante dont nous ignorons tout de laspect, nous allons rechercher des molécules organiques provenant dun métabolisme cellulaire classique. Le biocapteur de Pégase est conçu pour reconnaître le saccharose. 1. Préparatifs. L'enzyme utilisée pour la reconnaissance est l'invertase. Les conditions environnementales ne permettent pas d'utiliser une enzyme libre en solution Celle-ci se décomposerait en quelques instants. C'est pourquoi il faut préparer l'invertase sous forme immobilisée. Plusieurs techniques sont possibles. Nous allons tester deux d'entre elles. Inclusion dans lalginate. Adsorbtion sur DEAE sépharose Ces méthodes sont comparées à un témoin denzyme libre.

9 2. Gamme d'étalonnage du sucre inverti Préparation de la solution mère. Préparer par pesée, 200 mL d'une solution de concentration 10 mmol.L -1 d'un mélange égal de glucose et de fructose. C = m/M x 1/V -----> m = C x M x V m = 0,01 x 180 x 0,2 = 0,360 g m glu = m fru = C =(m glu + m fru ) /180 x 1/0,2 x 1000 = mmol.L -1 Cette partie permet de convertir l'activité des différentes préparations dabs.mn -1 en mol.L -1.mn -1

10 2.2. Préparation et dosage de la gamme. Préparer une série de tubes en suivant les consignes du tableau suivant. C tube = C mère x V mère / V tot Vol sol mère00,20,40,60,81,01,2 Vol eau distillée2 Vol Tp pH 4, DNS Vol sol mère00,20,40,60,81,01,2 Vol eau distillée21,81,61,41,210,8 Vol Tp pH 4, DNS C après DNS (en mmol.L -1 ) 00,40,81,21,622,4 V tot = 3 mL avant DNS V tot = 5 mL après DNS 2. Gamme d'étalonnage du sucre inverti. Cette partie permet de convertir l'activité des différentes préparations dabs.mn -1 en mol.L -1.mn -1

11 2.2. Préparation et dosage de la gamme. 2. Gamme d'étalonnage du sucre inverti. Cette partie permet de convertir l'activité des différentes préparations dabs.mn -1 en mol.L -1.mn Vol sol mère00,20,40,60,81,01,2 Vol eau distillée21,81,61,41,210,8 Vol Tp pH 4, DNS C après DNS (en mmol.L -1 ) 00,40,81,21,622, Vol sol mère00,20,40,60,81,01,2 Vol eau distillée21,81,61,41,210,8 Vol Tp pH 4, DNS C après DNS (en mmol.L -1 ) 00,40,81,21,622,4 Abs0,0840,2240,3750,5300,6670,892 Dosage La droite ne passe pas par 0 Cest normal ! La droite est correcte sans plus ! C = (Abs-b) / a Labsorbance est obtenue après 5 minutes dincubation. On peut en déduire que: V exp = (Abs – b) / a en mmol.L -1.(5mn) -1

12 3. Dosage de lenzyme libre. - Verser dans un tube: - 0,25 mL d'invertase diluée au 1/? (dans du Tp 4,7). - 0,5 mL de saccharose (C = 1,2 mol.L -1 ) - 2,5 mL de Tp 4,7 - Incuber 5 mn à 40°C -----> agiter régulièrement. - Verser 2 mL de DNS dans la solution - Le porter à 100°C pendant 5 mn exactement - Refroidir. - Ajouter 15 mL d'eau distillée. - Lire l'absorbance à 530 nm > si l'absorbance n'est pas adaptée à un dosage précis, changer la dilution. Vez = 0,25 mL Ez Ez Dilution D Vtot = 5,25 mL Abs Act exp = (Abs – b) / a Act lib = Act exp / t x 1/D x V tot /V Ez par mL dEz pour lEz pure par min Ez diluée Act lib = Act exp x 4,2 x 1/D Act Ez

13 4. Inclusion dans lalginate. La voix du commandant retentit dans le haut parleur du laboratoire. -- Le ministère de lexpansion de la foi veut une photo des responsables de la mission Pégase. -- Tu es sûr ? Il sagit de Ripley, Eva et moi. Nous ne sommes pas en odeur de sainteté. -- Le parti veut démontrer quil défend la cause des femmes en leur permettant daccéder à des postes de responsabilité. -- Si nous sommes ici, cest grâce au régime précédent qui était laïc ! -- Je sais, ce nest quune question politique. Et puis les ordres sont les ordres. Rendez-vous près du drone dans une demi-heure pour la séance photo. Préviens les deux autres et exécution ! Angie explique la situation à ses deux amies. Ripley est furieuse. -- Ces Enfoirées nous ont condamnées au camp de redressement et nous devrions faire les guignols pour leur image de marque ? -- Cest peut-être un moyen pour rentrer en grâce. -- On ne peut pas faire confiance à des fanatiques ! Ils nont aucune morale. Ce qui compte cest la diffusion de leur idéologie, quimportent les individus. Ils nous crucifieraient sans scrupules.

14 4. Inclusion dans lalginate. -- Je crois que jai une idée, dit Eva avec lœil pétillant. Ils veulent une photo, ils ne vont pas être déçus. Jai cousu deux trois petites choses spéciales filles. Eva sort trois tenues de son caisson de rangement. -- Je ne peux pas mettre ça, sindigne Ripley. Jai horreur des robes. Et tu as vu la longueur de celles-ci ? Cest une véritable provocation. Angie enfile le vêtement sans se faire prier. -- Les amazones sont toujours prêtes à se battre. Pense quà lépoque, les femens étaient encore moins vêtues ! -- Cest qui ces femens ? Ce sont les habitants de Dune ? Qui sont les femens? A qui Eva fait-elle allusion avec les habitants de Dune ?

15 4. Inclusion dans lalginate. Un mélange de solution enzymatique et d'alginate de sodium est déposé goutte à goutte dans une solution de CaCl 2. En présence de calcium, l'alginate forme un gel (ce qui se traduit par la formation de billes) emprisonnant l'enzyme dans ses mailles. Ces billes sont stables en absence d'agents complexant du calcium Principe. Ez A quel point cette technique est-elle efficace ? Ez partiellement incluse. Ez partiellement relarguée. Ez partiellement inefficace. S P

16 4. Inclusion dans lalginate. - Mélanger: - 0,5 mL d'invertase diluée au 1/? dans du Tp 4,7 - 2,5 mL d'alginate à 2% - Laisser tomber goutte à goutte le mélange, d'une hauteur de 20 cm environ, avec une pipette de 10 mL dans 100 mL d'une solution de CaCl 2 (C = 0,15 mol.L -1 ) légèrement agitée > Utiliser un Bécher de 250 mL par exemple. - Laisser séjourner les billes 30 minutes dans le CaCl 2. - Les rincer à l'eau distillée. - Les égoutter. - Compter le nombre de billes obtenues Inclusion dans l'alginate. Ez diluée V Ez = 0,5 mL Ez V arg nintervient pas dans les calculs car la totalité est versé dans le CaCl 2. + arginate 4.3. Détermination de l'activité immobilisée. - Verser dans un tube: - 8 billes - 0,5 mL de saccharose (C = 1,2 mol.L -1 ) - 2,5 mL de Tp 4,7 - Incuber 5 mn à 40°C -----> agiter régulièrement. - Verser 2 mL de DNS dans la solution - Le porter à 100°C pendant 5 mn exactement - Refroidir. - Ajouter 15 mL d'eau distillée. - Lire l'absorbance à 530 nm Détermination de l'activité résiduelle. Effectuer le même dosage en utilisant 0,25 mL de solution de CaCl 2. N billes V tot = 5,0 mL % Ez utilisée = 8 / N V rés = 0,25 mL V tot = 5,25 mL Abs On néglige le volume des billes. V CaCl2 = 50 mL

17 4. Inclusion dans lalginate. Ez diluée V Ez = 0,5 mL Ez V arg nintervient pas dans les calculs car la totalité est versé dans le CaCl 2. + arginate 4.3. Détermination de l'activité immobilisée Détermination de l'activité résiduelle. N billes V tot = 5,0 mL % Ez utilisée = 8 / N Abs Act exp = (Abs – b) / a Act imm = Act exp / t x N/8 x V tot /V Ez x 1 / D Une partie (8 / N) seulement des 0,5 mL denzyme diluée a été dosée par le DNS (V = 5 mL) par mL dEzpour lEz purepar min Act imm = Act exp 0,25 x N x 1 / D

18 4. Inclusion dans lalginate. Ez diluée V Ez = 0,5 mL Ez V arg nintervient pas dans les calculs car la totalité est versé dans le CaCl 2. + arginate 4.3. Détermination de l'activité immobilisée Détermination de l'activité résiduelle. V rés = 0,25 mL V tot = 5,25 mL Abs Act exp = (Abs – b) / a Act imm = Act exp / t x N/8 x V tot /V Ez x 1 / D Act rés = Act exp / t x 1/d1 x 1/d2 x 1/D x 1/V Ez Les 0,5 mL denzyme sont dilués: par le CaCl 2 (d1 = 0,5 / 50) par le DNS (d2 = 0,25 / 5,25) Act rés = Act exp x 840 / D Act imm = Act exp 0,25 x N x 1 / D

19 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose Principe. A pH 7, l'invertase dont le pHi est de 4,5, est chargée négativement et peut être adsorbée sur un support chargé positivement, le DEAE-Cellulose DEAE

20 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose Adsorbtion. centrifugation - Verser dans un tube: - 1 ml d'invertase - 10 mL (100 mg ds Tp) de DEAE-Cellulose - Mélanger doucement (par retournement). - Laisser reposer 30 mn à température ambiante, en mélangeant toutes les 10 minutes. - Centrifuger 10 mn à rpm Ez diluée V Ez = 1 mL Ez V DEAE = 10 mL + DEAE V Tp7 = 10 mL

21 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose. centrifugation Ez diluée V Ez = 1 mL Ez V DEAE = 10 mL + DEAE 5.3. Dosage. - Récupérer le surnageant -----> mesurer son volume. - Remettre en suspension le culot dans 10 mL de Tp 7 - Noter le volume total. - Verser dans un tube à essai: - 0,1 mL de culot remis en suspension ou de surnageant. - 0,5 mL de saccharose (1,2 mol.L -1 ) - 2,4 mL de Tp 4,7 - Incuber 5 mn à 40°C en agitant régulièrement. - Verser le liquide dans un tube contenant 2 mL de DNS - Le porter à 100°C pendant 5 mn exactement - Refroidir. - Ajouter 15 mL d'eau distillée. - Lire les absorbances à 530 nm. Respecter la valeur de pH du tampon. V Sgt V Tp7 = 10 mL V = 0,1 mL V tot = 5 mL V = 0,1 mL V tot = 5 mL Abs

22 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose. centrifugation Ez diluée V Ez = 1 mL Ez V DEAE = 10 mL + DEAE 5.3. Dosage. V Tp7 = 10 mL V = 0,1 mL V tot = 5 mL Abs Activité des billes de DEAE. Act exp = (Abs – b) / a Les 1 mL déchantillon sont dilués: par le Tp7 ( d1 = 0,1 / 10 ) par le DNS ( d2 = 0,1 / 5 ) Act DEAE = Act exp / t x 1/d1 x 1/d2 x 1/D x 1/V Ez Act DEAE = Act exp x 500 x 1/D

23 5. Immobilisation par adsorption ionique sur DEAE-Cellulose. centrifugation Ez diluée V Ez = 1 mL Ez V DEAE = 10 mL + DEAE 5.3. Dosage. V Sgt V = 0,1 mL V tot = 5 mL Abs Activité du surnageant. Les 1 mL déchantillon sont dilués: par le Tp7 (d1 = 1 / V Sgt ) par le DNS (d2 = 0,1 / 5,1) V DEAE = V exp / t x V Sgt x 1/d2 x 1/D x 1/V Ez V DEAE = V exp x 51 x V Sgt x 1/D V exp = (Abs – b) / a


Télécharger ppt "TP 10 Enzymes immobilisées. 1. Préparatifs. La lumière séteint dans la salle de briefing. Un hologramme de la planète géante apparaît. Pour une fois,"

Présentations similaires


Annonces Google