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De la culture cellulaire à lexpression de protéines impliquées dans la réorganisation du cytosquelette Nicolas Bertrand & Myriam Baratin TD1 Initiation.

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1 De la culture cellulaire à lexpression de protéines impliquées dans la réorganisation du cytosquelette Nicolas Bertrand & Myriam Baratin TD1 Initiation à la culture cellulaire TD2 Les différentes méthodes de transfection cellulaire Les petites protéines G de la famille Rho TD3 Description des protocoles

2 Initiation à la culture cellulaire Culture primaire/secondaire Les milieux de culture/maintien des lignées Les paramètres physico-chimiques Matériel et instruments La congélation Les contaminations

3 C'est une culture de cellules qui proviennent directement d'un tissu. Cette première culture pourra, par la suite, donner lieu à des cultures dites "secondaires« culture de cellules Traumatisme Contamination 1- culture primaire/secondaire Culture primaire Culture secondaire Des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). Ce sont des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.lignées cellulairescancérisation

4 Transformation cellulaire: acquisition de caractères propres à la cellule maligne Autonomie de croissance Perte de linhibition de contact Immortalité Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance et des interactions avec la MEC Tumorigénicité chez la souris nude

5 Immortalisation cellulaire Cellules post-crise Immortalisation spontanée (fibroblastes murins) Cellules immortalisées par lexpérimentateur (expression doncogènes viraux, de la télomérase) Cellules tumorales Hela: carcinome Raji: lymphome de Burkitt

6 How can cells be made immortal? Several methods exist for immortalizing mammalian cells in culture. Viral genes, including Epstein-Barr virus (EBV), Simian virus 40 (SV40) T antigen, adenovirus E1A and E1B, and human papillomavirus (HPV) E6 and E7 can induce immortalization by a process known as viral transformation. Although the process is reliable and relatively simple, these cells may become genetically unstable (aneuploid) and lose the properties of primary cells. For the most part, these viral genes achieve immortalization by inactivating the tumor suppressor genes that put cells into a replicative senescent state. The preferred method to immortalize cells is through expression of the telomerase reverse transcriptase protein (TERT), particularly those cells most affected by telomere length (e.g., human). This protein is inactive in most somatic cells, but when hTERT is exogenously expressed the cells are able to maintain telomere lengths sufficient to avoid replicative senescence. Analysis of several telomerase-immortalized cell lines has verified that the cells maintain a stable genotype and retain critical phenotypic markers.

7 Cell line SpeciesCell typeYear Estab. MDCKdogkidney1958 CHOhamsterovary epithelial1957 CV- 1/COS monkeykidney1964 NIH 3T3mouseembryo fibroblast1963 Rat-1ratembryo fibroblast1968 HeLahumancervical carcinoma1951 HEK- 293 humanembryonic kidney1977 LNCaPhumanprostate tumor1977 MCF7humanmammary tumor1973

8 Deux sources de cellules sont possibles : 1 - Les cellules circulantes (en suspension ) sang moelle osseuse liquides physiologiques 2- Cas des cellules à partir de tissus ou d'organes (adhérentes)

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10 Designations:EL4 Depositors: M Cohn Biosafety Level:1 Shipped:frozen Medium & Serum:See Propagation Growth Properties:suspension Organism:Mus musculus (mouse) Morphology: lymphoblast Source: Disease: lymphoma Strain: C57BL/6N Cell Type: T lymphocyte; Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location.MTAATCC and/or regulatory permitsclick here Applications: transfection host (Nucleofection technology from Lonza Roche FuGENE® Transfection Reagents)Nucleofection technology from Lonza Roche FuGENE® Transfection Reagents Antigen Expression:H-2b; Thy-1.2 Cytogenetic Analysis:modal number = 39 Comments: EL4 was established from a lymphoma induced in a C57BL mouse by 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene. [22448] The cells are resistant to 0.1 mM cortisol and sensitive to 20 mcg/ml PHA. A subline (EL4.IL-2, ATCC TIB-181) that produces high levels of interleukin-2 (IL-2, interleukin 2) is available. Tested and found negative for ectromelia virus (mousepox).22448TIB-181 Propagation: ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Catalog No To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: horse serum to a final concentration of 10%. Temperature: 37.0°C Subculturing: Medium Renewal: Every 2 to 3 days Cultures can be maintained by addition or replacement of fresh medium. Start cultures at 2 X 10 exp5 cells/ml and maintain between 1 X 10 exp5 and 1 X 10 exp6 cells/ml. Preservation:culture medium 95%; DMSO, 5%

11 The ATCC Cell Biology Collection is the most comprehensive and diverse of its kind in the world, consisting of over 3,400 cell lines from over 80 different species. It holds over 950 cancer cell lines, 1,000 hybridomas and several special collections including stem cells.950 cancer cell lines 1,000 hybridomas American Type Culture Collection (ATCC) a nonprofit organization in Rockville, Maryland

12 Pourquoi mettre des cellules en culture? Modèle pour létude de la physiologie cellulaire Conservation des caractéristiques du tissu initial Accessibilité Contrôle de lenvironnement et de traitements appliqués Homogénéité des cellules Matériel en grande quantité

13 Cycle de croissance d'une lignée cellulaire en culture in vitro Immortalisation cellulaire: Acquisition de la capacité à se multiplier indéfiniment

14 Culture continue Mort cellulaire Nombre de cellules Temps (jours) Phase de latence Phase exponentielle Phase stationnaire Phase de latence pas de division cellulaire dépend du type cellulaire, du milieu de culture, de la densité cellulaire Phase exponentielle Phase de division cellulaire Temps de doublement selon le type cellulaire (4h à 48h) Phase stationnaire Epuisement du milieu = arrêt de la prolifération Poursuite de la croissance cellulaire (repiquage) ou mort cellulaire

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16 Cellules de mammifères A priori, se rapprocher le plus possible des conditions du milieu intérieur

17 Reproduction et maintien dun environnement physiologique Paramètres physiologiques Température 37°C, permissivité faible Ions inorganiques aspect qualitatif et osmolarité pO2 et pCO2 pH Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%) CO2 + H2O HCO3- + H+ Indicateur coloré: Rouge de Phénol Hygrométrie 85% (évaporation) Lumière visible à éviter

18 Fourniture daliments essentiels Métabolisme énergétique Biosynthèse Catalyse enzymatique (vitamines, oligoéléments) Surface de culture Cas des cellules adhérentes avec dépendance à lancrage

19 Mise à disposition de molécules de transport PourHormones Oligoéléments Lipides Mise à disposition de facteurs dadhérence En fonction de la capacité des cellules utilisées à produire ces facteurs en plus ou moins grande quantité Mise à disposition de molécules informatives Hormones Facteurs de croissance

20 Reproduire lenvironnement physiologique Les milieux La base: milieu synthétique - acides aminés - sels minéraux - NRJ (glucose/glutamine) - Vitamines (fragiles, ne pas autoclaver) Les Suppléments - Indéfini: sérum (albumine/transferrine/hormones) extrait de tissus milieu conditionné - Défini: Facteurs de croissance Les antibiotiques - Éliminer complètement le contaminant microbien - Ne pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules - Compatible avec les autres éléments du milieu - Large spectre daction

21 Glycine L-Arginine hydrochloride L-Cystine 2HCl L-Glutamine L-Histidine hydrochloride- H2O L-Isoleucine L-Leucine L-Lysine hydrochloride L-Methionine L-Phenylalanine L-Serine L-Threonine L-Tryptophan L-Tyrosine disodium salt dihydrate L-Valine Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X) liquid (high glucose) Contains 4500 mg/L D-glucose, L-glutamine and 25 mM HEPES buffer but no sodium pyruvate or phenol red.

22 Vitamins Choline chloride D-Calcium pantothenate Folic Acid Niacinamide Pyridoxine hydrochloride Riboflavin Thiamine hydrochloride i-Inositol Inorganic Salts Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O) Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.) Potassium Chloride (KCl) Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sodium Chloride (NaCl) Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4-H2O) Other Components D-Glucose (Dextrose) HEPES

23 Technical Resources - Media Formulations Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (1X) liquid Advanced D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a defined media formulation designed to reduce significantly the amount of serum required for cultivating mammalian cell in vitro. This enhanced standard basal formulation allows for a % reduction in the required serum supplementation with no cell adaptation needed. Suitable for the growth of maintenance of a variety of common cell lines including MDBK Hep-2 COS-7 A549 MDCK WI-38 and others this medium supports cell growth and morpholigical characteristics of both adherent and non-adherent cell lines. It is formulated without L-glutamine for increased stability. Supplementation with L-glutamine is required. Recommended concentration of serum is 1 - 5%; the concentration must be adjusted for each individual cell line to achieve optimal results.

24 Amino Acids Glycine L-Alanine8.9 L-Arginine hydrochloride84 L-Asparagine13.2 L-Aspartic acid13.3 L-Cystine 2HCl63 L-Glutamic Acid14.7 L-Histidine hydrochloride- H2O 42 L-Isoleucine105 L-Leucine105 L-Lysine hydrochloride146 L-Methionine30 L-Phenylalanine66 L-Proline11.5 L-Serine52.5 L-Threonine95 L-Tryptophan16 L-Tyrosine disodium salt dihydrate 104 L-Valine94

25 Vitamins Ascorbic Acid phosphate2.5 Choline chloride4 D-Calcium pantothenate Folic Acid Niacinamide4 Pyridoxine hydrochloride4 Riboflavin0.4 Thiamine hydrochloride4 i-Inositol7.2 Inorganic Salts Calcium Chloride (CaCl2) (anhyd.) Ferric Nitrate (Fe(NO3)3"9H2O)0.1 Magnesium Sulfate (MgSO4) (anhyd.)97.67 Potassium Chloride (KCl)400 Sodium Bicarbonate (NaHCO3)3700 Sodium Chloride (NaCl)6400 Sodium Phosphate dibasic (Na2HPO4-H2O)125 Proteins AlbuMAX® II400 Human Transferrin (Holo)7.5 Insulin Recombinant Full Chain10 Trace Elements Ammonium Metavanadate Cupric Sulfate Manganous Chloride Sodium Selenite0.005 Other Components D-Glucose (Dextrose)4500 Ethanolamine1.9 Glutathione (reduced) Phenol Red15 Sodium Pyruvate110

26 Ethanolamine Glutathione (reduced) Ascorbic acid phosphate Insulin Human (holo) transferrin AlbuMAX (a lipid-rich bovine serum albumin) Trace salts sodium selenite, ammonium matavanadate, cupric sulfate, and manganous chloride Each Advanced medium is the standard published basal formulation, supplemented with NEAA and sodium pyruvate. Weve also added these ingredients to allow serum reduction:

27 Contaminations Contaminants biologiques Bactéries Levures/moisissures Virus Mycoplasmes Contaminants chimiques Endotoxines Qualité du plastique Reste de détergent Trace daluminium Résidus désinfectants Contamination croisée Autres cellules

28 Micro-organisme procaryote de type bactérien, dépourvu de paroi rigide (possédant une simple membrane) et capable de multiplication autonome. Mycoplasme

29 Un antibiotique [1] (du grec anti : « contre », et bios : « la vie ») est une substance qui a une action spécifique de bloquage ou même de destruction des bactéries. Pour les autres micro-organismes, on utilise le terme d'« antifongique » s'il s'agit de lutte contre les champignons, ou d'« antiviral » s'il s'agit de lutte contre les virus. [1]grecsubstancebactériesantifongiquechampignonsantiviralvirus Cette substance peut avoir une action toxique directe, c'est-à-dire bactéricide ; son efficacité peut être également limitée à empêcher le développement des micro-organismes (action bactériostatique).bactéricidemicro-organismesbactériostatique

30 Antibiotiques doivent: Eliminer complètement le contaminant microbien Ne doivent pas affecter la viabilité ou le métabolisme des cellules Compatible avec les autres éléments du milieu Large spectre daction Beta-lactamine Aminoside

31 Les pénicillines sont des antibiotiques bêta- lactamines. À la base, la pénicilline est une toxine qui provient de la moisissure penicillium provenant du champignon Penicillium notatum et qui est inoffensive pour l'homme.antibiotiques bêta- lactaminespenicilliumPenicillium notatum Les pénicillines ont pour formule chimique : R-C 9 H 11 N 2 O 4 SC H N O S où R est une chaîne variable. Les pénicillines et les autres antibiotiques β-lactames agissent par inhibition de la formation des liens inter-peptidoglycanes dans la paroi cellulaire bactérienne. La moitié bêta-lactame des pénicillines se lie à l'enzyme (transpeptidase) qui devrait se lier aux molécules de peptidoglycane des bactéries et empêche ainsi la multiplication des bactéries.antibiotiques β-lactamespeptidoglycanesparoi cellulairebêta-lactameenzymemoléculesbactéries Pénicilline G Les pénicillines A sont des aminopénicilline à spectre élargi. L'ampicilline et surtout l'amoxicilline sont ses deux principaux représentants.ampicillineamoxicilline

32 La streptomycine est un antibiotique antibactérien cytostatique et cytotoxique. Il appartient à la classe des aminosides (ou aminoglycosides)antibiotique aminosides Il fut isolé à partir d'une souche d'actinobactérie Streptomyces griseus Le spectre d'action de la streptomycine est assez large puisqu'elle peut agir sur certains bacilles gram négatifs (comme Escherichia coli) ou certains cocci gram positifs (comme le Staphylococcus aureus). Cet antibiotique agit également sur Mycobacterium tuberculosis, et fut d'ailleurs le premier antibiotique contre la tuberculose.bacillesgram négatifsEscherichia colicoccigram positifsMycobacterium tuberculosistuberculose Action par fixation sur la petite sous-unité des ribosomes eubactériens: synthèse protéique aberrante. Effet bactéricide.

33 La tétracycline est un antibiotique produit par une bactérie du genre Streptomyces. Elle est indiquée contre nombre d'infections bactériennes.antibiotique bactérieStreptomyces La tétracycline empêche la fixation de l'aminoacyl-ARNt entrant dans le site A du ribosome. Effet bactériostatique. Spectre : bactéries Gram positif et Gram négatifGram positifGram négatif

34 Matériel et instruments

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38 NON!!!

39 Matériel et instruments PSM: Poste de Sécurité Microbiologique (de type II) Ne pas introduire trop d'objets perturbe le flux & la sécurité manipulateur Ne pas introduire d'objet poussiéreux colmate le filtre Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile

40 Matériel et instruments Microscope inversé à contraste de phase

41 Matériel et instruments

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43 Étuve à CO2

44 Technique Aseptique pour culture cellulaire Hygiène: cheveux attaches Se laver les mains avant après. Port de gants blouse Ethanol 70% mais attention à la perméabilité La peau contient naturellement des bactéries et des champignons qui adorent les milieux de culture Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile flasques pipettes Environnement: PSM poste de sécurité microbiologique Nettoyage des hottes: TFD7 ou RBS détergent désinfectant Eau Ethanol Nettoyer les flacons à mettre sous la hotte

45 Congélation/DécongélationButs Préserver Éviter sénescence Limiter risque de contamination Minimiser les variations génétiques (perte ou doublement des chromosomes) Agents cryo-protecteurs DMSO GlycérolQuand/Comment Phase exponentielle, suspension entre 10 6 et 10 8 cellules par mL On congèle dans le milieu complet Temps déquilibration avec les cryoprotecteurs à la température du laboratoire Congélation graduelle à -40°C/-80°C lentement (1 ou 4°C par min) puis dans lazote liquide (-196°C)Décongélation rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un contrôle de viabilité Pendant ces phases, on limite les autres stress appliqués aux cellules

46 Fourchette de température critique -15°C/-60°C Jusquà -5°C, pas de congélation du milieu ni des liquides intracellulaires Entre -5°C et -15°C, le milieu commence à congeler mais pas les liquides intracellulaires conséquence: les cellules se déshydratent (leau intracellulaire sort) Le refroidissement lent permet une déshydratation efficace et limite la congélation intracellulaire qui entraîne la mort de la cellule. Plus les cellules sont grandes et plus le refroidissement en général doit être lent. Cette première condition doit être remplie mais nest pas suffisante. En effet, il semble que les changements de forme induit par la perte deau et ceci en présence de quantité de glace extracellulaire croissantes sont anisotropes (distorsion), ce qui provoquerait des lésions cellulaires. Dautre part, laugmentation de concentration des solutés serait aussi délétère. Le refroidissement est lent, on augmente la durée dexposition aux forces de distorsion. Les agents cryoprotecteurs agiraient en diminuant le problème: ils permettent daugmenter la fraction non congelée et donc limite la déshydratation et laction des forces de distorsion. La vitesse de décongélation est importante aussi. En général, une décongélation et un réchauffement trop lent sont délétères pour la survie des cellules.


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