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CREATIS, CNRS UMR 5220, Inserm U1044 INSA Lyon Université de Lyon Encadrants : H. Ratiney, D. Friboulet Equipe : RMN & Optique Financement : Allocation.

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1 CREATIS, CNRS UMR 5220, Inserm U1044 INSA Lyon Université de Lyon Encadrants : H. Ratiney, D. Friboulet Equipe : RMN & Optique Financement : Allocation de recherche

2 Plan Contexte et Objectif de la thèse – SRM 1D quantitative : introduction et limitations – SRM 2D : de la haute résolution à une application in vivo quantitative? Axes de développement – Quantification – Simulation – Acquisition Perspectives

3 SRM in vivo : Potentiels et enjeux Spectroscopie RMN : permet une quantification et exploration métabolique non invasive et longitudinale in vivo Information métabolique comme descripteur de phénomènes physiologiques – Une variation en concentration de certains métabolites permet de caractériser biochimiquement une pathologie ex : stéatose 1, cancer 2, … [1] Klein, M. S., Dorn, C., Saugspier, M., Hellerbrand, C., Oefner, P. J., & Gronwald, W. (2010). Discrimination of steatosis and NASH in mice using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Metabolomics, 7(2), [2] Duarte, I. F., & Gil, A. M. (2012). Metabolic signatures of cancer unveiled by NMR spectroscopy of human biofluids. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy, 62, Elsevier B.V

4 Caractéristiques dun spectre Déplacement chimique Couplage scalaire Résultats de quantification dun spectre acquis à TE courts (6ms ) à 500 Mhz: en rouge le spectre estimé, en bleu cyan le spectre original, en bleu le spectre de macromolecule estimé, en noir le résidu Image pondérée en T2 dun cerveau de souris acquise à 500 Mhz

5 Le déplacement chimique Fréquence de résonance Production dun moment magnétique induit par le cortège électronique sopposant à B0 Déplacement chimique en ppm:

6 Le couplage scalaire Interaction magnétique entre les noyaux : létat de spin dun noyaux peut affecter son voisin. Couplage spin-spin ou scalaire Ce couplage est "transporté" par les électrons de liaison 13 C 1H 1H 1J 1J Couplage hétéro-nucléaire 1H 1H 1H 1H 3J 3J Couplage homo-nucléaire n J AX en Hz -> n nombre de couplage entre A et X Apparition de structures en multiplet dans les spectres Exemple de léthanol pur à 95 % CH 2 CH 3

7 Spectroscopie 1D in-vivo Le signal de spectroscopie provient dun seul volume de léchantillon Aire dune résonance donne accès à la concentration = Quantification : déterminer les contributions de chaque molécules dans le signal de spectroscopie Une vingtaine de métabolites détectables à haut champs Une dizaine quantifiable (dans le cerveau) 3 [3] Govindaraju, V., Young, K., & Maudsley, A. A. (2000). Proton NMR chemical shifts and coupling constants for brain metabolites. NMR Biomed, 13(3), Contribution des métabolites sur un spectre cérébral PRESS

8 Spectroscopie 1D Spectre PRESS dun raton sain de 14 jours à 400 MHz Méthode limitée par sa sensibilité, sa résolution 4 Problème denchevêtrement spectral 5 Phénomène de J-Modulation Comment saffranchir de ces contraintes ? Haut-champs : B0 ++, S/B ++, dispersion spectrale ++ 2D [4] Van, Q. N., Issaq, H. J., Jiang, Q., Li, Q., Muschik, G. M., Waybright, T. J., Lou, H., et al. (2008). Comparison of 1D and 2D NMR Spectroscopy for Metabolic Profiling research articles. Journal of Proteome Research, [5] Gonenc, a, Govind, V., Sheriff, S., & Maudsley, a a. (2010). Comparison of spectral fitting methods for overlapping J-coupled metabolite resonances. Magnetic resonance in medicine: official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine, 64(3), doi: /mrm.22540

9 Objectif de la thèse Quantifier de manière fiable un maximum de métabolites/ composants biochimique Saffranchir des contraintes de SRM 1D in vivo Méthode SRM 2D in vivo quantitative

10 Spectroscopie 2D Idée de J. Jeener Augmenter la résolution spectrale en ajoutant une dimension supplémentaire dans le spectre 6 PréparationEvolutionMélangeDétection t1t2 Chronogramme type dune séquence de spectroscopie 2D S(t1,t2) Encodage de linfluence du couplage scalaire ( J ) et du déplacement chimique ( δ ) selon deux dimensions temporelles. [6]: J. Jeener, Ampere Summer School, Basko Polje, Yugoslavia (1971) (unpublished). RF S(t2) 1D 2D

11 Spectroscopie 2D Séquences 2D Après transformée de Fourier 2D en (t1,t2) on obtient la répartition en fréquence dun signal de corrélation 7 FFT2 FID 2D (t1, t2)Spectre 2D (f1,f2) [ 7] Akoka, S. (n.d.). UNE INTRODUCTION A LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE Chapitre 9: Spectroscopie RMN quantitative.

12 Étude bibliographique Principales Séquences de corrélation Homo-nucléaires Une multitude de séquences (~20) de SRM 2D haute résolution Quelles sont celles qui saccordent avec notre problématique ? (quantification in vivo) – COSY (COrrelated SpectroscopY) 8 première expérience de spectroscopie de corrélation (Ernst) – CT-COSY (Constant Time COSY) 9 COSY ayant une durée tc avec une refocalisation. Permet davoir des pic de corrélation croisés dune intensité doublée et de cibler le couplage scalaire des systèmes de spin avec tc – TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) 10 permet de lever les ambiguïtés dattribution des taches de corrélation dune COSY quand on a des déplacements chimiques proches – SECSY (Spin Echo Correlation SpectroscopY) 11 Amélioration de la COSY avec une acquisition de lécho adaptée dans le temps [8] Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimension, R. R.Ernst, G. Bodenhausen, A. Wokaun, Oxford Science Publication [9]: Wu, Z., & Bax, a. (2001). Measurement of homonuclear proton couplings based on cross-peak nulling in CT-COSY. Journal of magnetic resonance (San Diego, Calif. : 1997), 151(2), [10]: Massou, S., Nicolas, C., Letisse, F., & Portais, J.-C. (2007). Application of 2D-TOCSY NMR to the measurement of specific(13C-enrichments in complex mixtures of 13C-labeled metabolites. Metabolic engineering, 9(3), [11]: K.NAGAYAMA, ANIL KUMAR, K. WÜTHRICH, R. R. E. (1980). Experimental techniques of two-dimensional correlated spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance, 40(2),

13 Développement pour des applications in vivo Contraintes In Vivo: Temps de relaxation ( T2200ms, T11500ms ) 11 Milieu ayant un champ magnétique inhomogène Nécessité de localiser Champ moyen ( MHz) Nécessité temps dacquisition court (protocole IRM+SRM<1h SRM <30 min) [12] Localized proton MRS at 7T in the rat brain: Estimated metabolie concentrations T2 relaxation times, 22st Annual Scientific Meeting of ESMRMB

14 Stratégie de développement SimulationQuantificationAcquisition

15 Quantification Signal SRM2D = combinaison linéaire de signaux 2D de métabolites 13 fort Signaux connus par simulation connaissance à priori fort Fonction modèle du signal de corrélation 14 exemple expérimentalmodélisé Variation des différents paramètres pour M métabolites en présence: jusquà 2M+3 paramètres [13] Jensen, J. E., Licata, S. C., Ongür, D., Friedman, S. D., Prescot, A. P., Henry, M. E., & Renshaw, P. F. (2009). Quantification of {J}-resolved proton spectra in two-dimensions with LCModel using GAMMA-simulated basis sets at 4 {Tesla}. NMR Biomed, 22(7), [14] J. Keeler, Understanding NMR Spectroscopy, Wiley Press SimuléModèle paramétrique Signal modélisé

16 Développement de séquences

17 COSY localisée (L-COSY) Mise en place dun pseudo-temps t1 en se basant sur une séquence PRESS Sous environnement de programmation Bruker et optimisation des gradients de sélection et de brouillage a: Cho, Tau, NAA, GABA, Cr, MIn, Lac, Gln, Glu B0 = 200Mhz NA =1 TR= 2500 ms t1: 256 pts t2: 1024 pts Résolution spectrale: 10 ppm Durée dacquisition: 10min Spectre LCOSY de 9 métabolites a Lac Glu Tau z x y π/2π t1t2 π/2 t1t2 Correlated SpectroscopY Localized-Correlated SpectroscopY

18 CT-COSY localisée (L-CTCOSY) Mise en place du pseudo-temps t1 et de la constant de temps tc en se basant sur une PRESS z x y π/2π (tc-t1)/2t2 (tc+t1)/2 b: Cho, Tau, NAA, GABA, Cr, MIn, Lac, Gln, Glu B0 = 200Mhz NA =1, TR= 2500 ms, tc = 80 ms t1: 256 pts t2: 1024 pts Résolution spectrale: 10 ppm Durée dacquisition: 10min Spectre L-CTCOSY de 9 métabolites b Lac Glu Tau π/2 tc t2 Constant Time Correlated SpectroscopY Localized-Constant Time Correlated SpectroscopY

19 Simulation GAMMA (General Approach to Magnetic resonance Mathematical Analysis) [15] S.A. Smith, T.O. Levante, B.H. Meier, R.R. Ernst, Computer Simulations in Magnetic Resonance. An Object-Oriented Programming Approach, Journal of Magnetic Resonance, Series A, Volume 106, Issue 1, January 1994, Pages , ISSN , /jmra Basé sur le formalisme des opérateur-produits Librairie C++ Permet de simuler des systèmes de spin plus complexes de manière numérique 15 Application sur les séquences COSY/CT-COSY pour les métabolites (sans prise en compte du phénomène de relaxation) : Cho, GABA, Lac, Tau, MIn, Glu, Gln, NAA COSY simulé CT-COSY simulé B0: 200MHz t1: 256 pts t2: 1024 pts dt1=dt2=0.001 s Temps de calcul: 25 ms B0: 200MHz t1: 256 pts t2: 1024 pts tc: 100 ms dt1=dt2=0.001 s Temps de calcul: 25 ms

20 Stratégie de développement Simulation Acquisition Traitement du signal Ex: COSY CTCOSY Nouvelles séquence ? GAMMA C++ Quantification: Prototypage MatLab CreaProject Synergie = Stratégie dacquisition

21 Perspectives Quantifier les signaux acquis par L-COSY et L-CTCOSY Apport du point de vue quantitatif de la nouvelle séquence 2D par rapport à celle existante au labo ? (théorie (simulation)/expérimentation) Réduction du temps de calcul Optimisation/développement de nouvelle séquence: – Réduction du Temps dacquisition – Réduction du nombre de paramètres à estimer / obtention de la meilleure fonction modèle Application in vivo ( MHz) – Caractérisation 2D des macromolécules/ lipides Publication à l étude 3-6 mois 2 e année

22 Spectroscopie 2D Différentes séquences Deux types 8 : Hétéro-nucléaire Excitation RF à la fréquence du nucléide sondé 9 Spin ½ : 13C, 15N, 31P Investigation de métabolites spécifiques : protéines, ADP/ATP, macromolécules 10 J-résolue et COSY hétéro-nucléaires Homo-nucléaire Excitation RF à la fréquence du proton Deux familles de séquences Séquences de corrélation : encodage +J en t1,t2 Séquences J résolue : encodage J en t1, en t2 Séquences développées pour la RMN haute-résolution [8]: Akoka, S. UNE INTRODUCTION A LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE Chapitre 7: RMN multi-impulsionnelle. [9]: Akoka, S. (n.d.). UNE INTRODUCTION A LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE Chapitre 6: Spectroscopie des noyaux de faible abondance naturelle. [10]:Ronconi, L., & Sadler, P. J. (2008). Applications of heteronuclear NMR spectroscopy in biological and medicinal inorganic chemistry. Coordination Chemistry Reviews, 252(21-22),

23 Étude bibliographique Principales Séquences de corrélation Homo-nucléaires COSY (COrrelated SpectroscopY): première expérience de spectroscopie de corrélation (Ernst) 11 TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY): permet de lever les ambiguïtés dattribution des taches de corrélation dune COSY quand on a des déplacements chimiques proches 12 SECSY (Spin Echo Correlation SpectroscopY): Amélioration de la COSY avec une acquisition de lécho adaptée dans le temps 13 CT-COSY: COSY ayant une durée tc avec une refocalisation. Elle permet de cibler certain système de spin en ajustant la durée tc selon J. Permet davoir des pic de corrélation croisés dune intensité doublée 14 [11] Principles of Nuclear Magnetic Resonance in One and Two Dimension, R. R.Ernst, G. Bodenhausen, A. Wokaun, Oxford Science Publication [12]: Massou, S., Nicolas, C., Letisse, F., & Portais, J.-C. (2007). Application of 2D-TOCSY NMR to the measurement of specific(13C-enrichments in complex mixtures of 13C-labeled metabolites. Metabolic engineering, 9(3), [13]: K.NAGAYAMA, ANIL KUMAR, K. WÜTHRICH, R. R. E. (1980). Experimental techniques of two-dimensional correlated spectroscopy. Journal of Magnetic Resonance, 40(2), [14]: Wu, Z., & Bax, a. (2001). Measurement of homonuclear proton couplings based on cross-peak nulling in CT-COSY. Journal of magnetic resonance (San Diego, Calif. : 1997), 151(2),

24 COSY COSY (Correlated SpectroscopY): Première expérience de spectroscopie de corrélation. Proposée par J. Jeener, mis en œuvre par Ernst 15 Donne accès à la connectivité -> permet de reconstruire la structure moléculaire du composé étudié +J encodés en t1 +J encodés en t2 π/2 t1t2 [15] Aue, W., Bartholdi, E., & Ernst, R. R. (1976). Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. The Journal of Chemical Physics, 64(5), 2229.

25 CT-COSY ππ/2 tc- t1/2 t2tc tc+t1/2 π/2

26 Formalisme des opérateurs produits Prédiction du signal des différentes séquences en utilisant le formalisme des opérateurs produit 15 : -Pour deux système de spin I & S: description de lévolution de leur matrice densité détat -Une impulsion = opérateur agissant sur ces matrices -Evolution en déplacement chimique () -Evolution en couplage scalaire (J) Préparation Impulsion π/2 Evolution J Mélange Impulsion π/2 Détection J [15] O.W. Sørensen, G.W. Eich, M.H. Levitt, G. Bodenhausen, R.R. Ernst, Product operator formalism for the description of NMR pulse experiments, Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, Volume 16, 1984, Pages Formule analytique du signal

27 Stratégie de développement SimulationQuantificationAcquisition


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