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Cours Spectrométrie de Masse Lionisation par électropray : lESI Cours ESBS Oct 2010 Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire.

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1 Cours Spectrométrie de Masse Lionisation par électropray : lESI Cours ESBS Oct 2010 Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique Dir : Alain Van Dorsselaer UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg Tel:

2 Les Sources dIonisation les plus utilisées Ionisation à Impact électronique (IE) Ionisation Chimique (IC) Ionisation par bombardement dions ou datomes rapides (LSIMS ou FAB) Petites molécules volatiles et thermostables molécules < 6000 Da Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents, protéomique Ionisation par électronébullisation (électrospray ES ou ESI) Désorption/Ionisation Laser assistée par Matrice (MALDI) DURES DOUCES ASSEZ DOUCES

3 Deux méthodes dionisation des biomolécules particulièrement efficaces et sensibles ont été inventées dans les années 90 et constamment améliorées : le MALDI et lESI (ElectroSpray Ionisation). LESI a les caractéristiques suivantes : - nécessite une introduction de léchantillon en solution - génère des ions multichargés (analyse de protéines) - fonctionne à pression atmosphérique - souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe dions. Lionisation par électropray : lESI

4 La source ES : historique - jusquen 1987 : limite de poids moléculaire des composés analysables par MS : Da dans les cas les plus favorables - depuis : apparition de la technique dionisation par électronébulisation (electrospray) et possibilité danalyser des composés de plusieurs centaines a plusieurs millions de Da) :John. B. FENN : Prix Nobel pour le développement de la technique dionisation pour lanalyse des biomolécules (1) Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers Whitehouse C.M., Dreyer R.N. Yamashita M. and Fenn J.B. Anal. Chem. 57, (1985) 2) Interpreting mass spectra of multiple charged ions Mann M., Meng C.K. and Fenn J.B. Anal. Chem. 61, , (1989)

5 Principe de lionisation Electrospray (ES) Lionisation ES repose sur lintroduction dune solution aqueuse du composé à analyser par un capillaire métallique très fin porté à un haut potentiel Cette tension crée des charges dans la solution A la sortie du capillaire, on a un « nébulisat » (spray) de gouttelettes (1 m) favorisé par une assistance pneumatique Lionisation par électrospray: ESI - génère des ions multichargés - souvent associée à un analyseur quadrupolaire, à temps de vol ou à trappe dions.

6 Structure dune source dionisation Electrospray (ES) Une source dionisation par ES est composée : - dun capillaire dans lequel est injecté léchantillon à analyser en solution - dun ensemble de lentilles électrostatiques permettant de transférer les ions de la zone à pression atmosphérique vers la zone dans laquelle règne un vide poussé V = 3000V 3 à 5 l/min cap. métal (75 m) TOF D Electrospray: Formation de gouttelettes chargées contenant la protéine Zone de désolvatation Zone de focalisation des ions Analyse des produits en fonction de leur rapport m/z Lionisation ES est un processus qui a lieu : - à température ambiante - à pression atmosphérique (ambiante) - sous laction dun champ électrique Lionisation ES génère des ions multichargés

7 Elle est basée sur un processus électrolytique de : H 2 O H + + OH - Elle se fait à pression atmosphérique, à température ambiante Lionisation par électronébulisation (electrospray): ES+ Certains OH - sont attirés, puis neutralisés par le capillaire métallique: OH - OH. Avec un voltage positif sur le capillaire on génère donc des gouttelettes chargées positivement à cause dun excès de protons qui se fixent les sites protonables.

8 Lionisation électrospray : principe de la production du spray Débit imposé par une pompe Tube capillaire 0 volt volts volts ………… Emission dun spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés. Le volume électronébulisé doit être égal au volume apporté par la pompe. Effet de pointe qui entraîne la déformation du liquide en gouttelettes chargées Champ électrique qui agit sur le liquide chargé

9 Electrospray: Formation de gouttelettes chargées sous leffet dun champ électrique

10 Lionisation électrospray : mécanisme de formation des ions Émission dun spray visible à la loupe. Ces gouttelettes sont expulsées, sèchent, entament des fissions, et génèrent des ions désolvatés Lionisation / désorption par ESI génère des ions en phase gazeuse en 3 étapes: 1- production de gouttelettes chargées à partir de lélectrolyte en solution 2- fissions des gouttelettes chargées en gouttelettes plus petites 3- « transfert » des ions en phase gazeuse Réduction de taille, mais nombre de charges électriques constant (explosions coulombiennes) ………… + ++ Evaporation du solvant +

11 Lionisation électrospray : mécanisme Au cours du trajet des ions dans le spectromètre de masse, il y a évaporation du solvant des gouttelettes. - diminution de la taille de la gouttelette - et augmentation parallèle de la densité de charges au sein de la gouttelette Il y a un équilibre entre tension de surface de la gouttelette et forces de répulsions coulombiennes. Plus le solvant sévapore, plus les forces de répulsion coulombiennes sont importantes. lorsque forces de répulsion coulombiennes > tension superficielle il y a explosion de la gouttelette en une gouttelette plus petite Au delà dun certaine limite appelée limite/diamètre de Rayleigh, on observe une fission des gouttelettes en gouttelettes de plus petites taille. Après plusieurs étapes de fissions/explosions, la densité de charge dans la gouttelette devient telle que le champ électrique local très intense conduit à le désorption des ions par effet de champ. Il se forme alors des ions solvatés constitués de lion analyte entouré de molécules de solvant et de nombreuses charges. Lévaporation des dernières molécules de solvant permet dobtenir un ion désolvaté contenant n charges, i.e. nH + : on parle dions multichargés

12 Lionisation électrospray : importance du débit pour la sensibilité ………… Débit de la pompe Débit du spray Le débit auquel un électrospray fonctionne a une importance capitale pour la sensibilité. Lintensité du courant dions produit dépend de la concentration de la solution et non pas du débit auquel la solution est injectée Il vaut donc mieux injecter une solution concentrée au débit le plus faible possible Lélectrospray est concentration – dépendant

13 Lionisation électrospray : débit élevés et débits faibles ………… Débit de la pompe Débit du spray DEBITS ELEVES ( microlitres par minute) En « électrospray pur », il est difficile de dépasser débit de plus de 1 microlitre par minute. Pour des débits supérieurs, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation. DEBITS FAIBLES (moins de 1 microlitre par minute) Plus lorifice qui émet le spray est petit, plus le débit du spray est faible. Aux très faibles débits (moins de 200 nanolitres par minute), il nest même plus nécessaire de pousser avec une pompe; laspiration électrostatique suffit à assurer le débit (nano spray) Pour avoir un spray stable, le volume électronébulisé doit être égal ou volume de solution apporté par la pompe.

14 Lionisation électrospray : pour les débits de spray élevés, il faut une assistance à la nébulisation (1 à 200 microlitres /min.) Pour dépasser un débit de 1 microlitre par minute, il faut une assistance pneumatique à la nébulisation. ………… Flux dazote comprimé ………… Capillaire denviron 100 microns de diamètre intérieur Débit de la pompe Des gouttelettes sont arrachées à la surface du cône de liquide.

15 Le système de "canne" d'introduction ESI Extrémité de canne d'introduction MICROMASS, montrant le capillaire en quartz qui amène le solution (75 microns de diamètre intérieur). Le gaz de nébulisation(azote) est améné de façon concentrique par le tube en métal. La tension de 3 à 4000 volts est appliquée sur le métal. Le tube de quartz ne doit dépasser que de 0,5mm.

16 Le système de "canne" d'introduction ESI

17 LESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min. Débit de la pompe ………… Débit du spray: de 0,1 à 1 µL/min MICRO SPRAY : capillaire de faible diamètre (20 à 75 microns) …….………… Orifice réduit (1 à 3 microns) NANO-SPRAY : selon Mann et al. Dautres nano-systèmes automatisés permettent des débits de quelques nano-litres par minutes (Advion,…) (Nano LC-MS) Débit du spray: de 1 à 200 nanoL/min m

18 E trop faible E spray instable E correct spray stable Capillaire nanospray vide LESI convient bien aux débits inférieurs à 1 µL/min.

19 Features 400 identical microfabricated nozzles Integrated grounded silicon electrode provides a high, uniform electric field equivalent to a 2-mm pulled capillary Des puces microfluidiques de nanoES : ESI Chip(Advion)

20 Avec une source ESI, l'analyseur peut être: Un quadrupôleLe moins cher et le plus facile Une trappe d'ionsMS-MS facile et pas cher Un temps de vol Meilleure résolution qu'un quadrupôle Un appareil magnétiqueDifficile et cher, mais de résolution Un FT-ICRCher, difficile et lent, mais très haute résolution

21 Avantages de lélectrospray - fonctionne à basse T°C, à pression atmosphérique, donc peu d énergie interne communiquée aux ions pas de dégradation, les liaisons covalentes ne sont pas rompues - mesure précise de la masse moléculaire (0.1%) soit ± 1 Da sur M = Da - permet d extraire des ions de large masse moléculaire (polymère, biomolécule) - sensible (C M) - permet dextraire des molécules polaires Inconvénients de lélectrospray - fournit peu dinformation sur la structure, sauf si on effectue de la MS/MS - très sensible à la présence de sels ou additifssuppression du signal dessalage impératif

22 Effet dagents contaminants pour lanalyse par ES-MS Le signal en ES est très sensible à la présence, même à faible concentration, dagents contaminants tels que : - les sels inorganiques (Na, K, etc…)> 1mM - les tampons non volatils (Tris, CHAPS, HEPES, phosphates, citrates, etc…) - les surfactants et les détergents (SDS, Triton, Tween, NP40, etc…)> 0.05% - les agents chaotropes (urée, sels de guanidine, etc…) - les solvants non volatils (glycérol, etc…)

23 Effet dagents contaminants pour lanalyse par ES-MS - Phénomène de compétition à lionisation : la présence de ces agents induits une suppression de lanalyte - Formation dadduits pour les contaminants faiblement volatils - Neutralisation de la charge portée par lanalyte (ex : SDS) - Modification de la tension de surface de la solution (détergents, glycérol) I mes A k A [A+] k A [A+] + k B [B+] = I Courant mesuré pour A k : efficacité dionisation Courant ionique produit en source

24 Effet dagents contaminants pour lanalyse par ES-MS Ncp7 (10 M) dans un tampon HEPES Ncp7 (10 M) dans H 2 O Na+ + HEPES 238 Da + HEPES (HEPES) 2 + HEPES

25 Lionisation par électrospray permet la mesure de masse de molécules très grosses. Mesurer des masses moléculaires très élevées est possible grâce à une caractéristique unique de l'ESI : ce mode d'ionisation génère des ions multichargés. Pour mesurer des masses moléculaires élevées, il n'est donc pas nécessaire de disposer d'un analyseur à gamme de balayage m/z élevée. La résolution de l'analyseur sera une caractéristique importante pour la mesure, soit des masses moyennes (chimiques) soit des masses monoisotopiques.

26 m/z m/z=1 La différence de masse apportée par la présence d1 isotope est de 1 Da donc le rapport m/z varie de 1/z Si z=1 m/z=1 z=2 m/z=0.5 z=3 m/z=0.33 etc z charges Comment déterminer létat de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES On se sert des profils isotopiques

27 m/z m/z=1 Si z=1 alors au niveau du profil isotopique m/z=1/1 = 1 z=2 m/z=1/2 = 0.5 z=3 m/z=1/3 = 0.33 etc ….. Comment déterminer létat de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES Entre 2 isotopes, m/z = 1 12 C 1 H 16 O 14 N 35 Cl 79 Br 13 C 15 N 18 O 37 Cl 81 Br

28 m/z m/z=1 Ici m/z= 1 : on en déduit que ce pic est 1x chargé (monochargé) Comment déterminer létat de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES On en déduit la masse monoisotopique du composé M= (500.0x1) – 1 = 499 Da

29 m/z m/z=0.5 Ici m/z= 0.5 : on en déduit que ce pic est 2x chargé (dichargé) Comment déterminer létat de charge du composé étudié à partir du spectre de masse ES On en déduit la masse monoisotopique du composé M= (500.0x2) – 2 = 998 Da

30 Spectre ESI dun peptide de masse monoisotopique 1340,6 Da avec résolution isotopique sur les ions à une et deux charges [M + H] + Massif isotopique monochargé [M + 2H] 2+ Massif isotopique Dichargé (différence de 0,5 m/z)

31 17 + Si réso Si pas de réso La détection du profil isotopique dépend de la résolution de lanalyseur (Ex de la myoglobine) On mesure la masse moyenne R = 2000 R = On mesure la masse monoisotopique

32 Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: L'ESI génère des ions multichargés A: ± 0.28 Da La masse M et le nombre de charge z sont dabord calculés à partir de 2 pics. Ensuite, M est calculée à partir de chacun des pics de la série dions multichagés. Dans cet exemple on observe 15 états de charges différents (10 à 24 charges). La masse mesurée sera donc le résultat de la moyenne de ces 13 mesures, doù la grande précision obtenue. Série dions multichargés. Tous ces pics correspondent à la même molécule, mais avec un nombre de protons différents.

33 Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: Il faut dabord déterminer les valeurs de z A: ± 0.28 Da m/z X1X1 X2X2 X z 1 = X 2 - X 1 z 2 = z X 1 = M + z 1 m H z1z1 X 2 = M + z 2 m H z2z2 Système de 2 équations à 2 inconnues Deux pics consécutifs permettent de déterminer M et Z 1 Calcul de Z:

34 Détermination de la masse moléculaire par ESI-MS: Il faut dabord déterminer les valeurs de z A: ± 0.28 Da X1X1 X2X2 X z 1 = X 2 - X 1 Calcul de Z: X 1 = M + z 1 z1z1 X 2 = M + z 2 z2z2 = = = – = z 1 = 19

35 m/zzMasse 679, ,00 707, ,44 737, ,77 721, ,00 808, ,88 848, ,60 893, ,56 942, ,06 998, , , , , , , ,34 Moyenne :16951,65 +/- 0,17 Da Calcul de la masse moléculaire de la myoglobine à partir de la série dions multichargés du spectre ESI Une fois que les valeurs de z sont déterminées (en résolvant le système déquation à 2 inconnues M et z), la masse moléculaire de la protéine est recalculée à partir de chaque pic. La moyenne des valeurs trouvées pour la masse moléculaire est calculée avec une déviation standard. Plus il y a dions multichargés, plus la masse pourra être mesurée avec précision Les masses calculées sont des masses chimiques et non pas des masses monoisotopiques car la résolution n'est pas suffisante pour séparer les pics isotopiques

36 Lionisation ESI est compatible avec une introduction directe ou par chromatographie de léchantillon Source InterfaceAnalyseur Introduction de l échantillon: - direct (infusion) - couplage LC Obtention d ions en phase gazeuse Focalisation et transmission des ions Séparation des ions en fonction du rapport m/z

37 Le couplage LC-MS : avec ou sans split HPLC rp Diviseur SM Détecteur UV Collecte des pics Edman Mesure de la masse moléculaire de chaque pic élué Time % % Trace UV Chromatogramme dions Spectre

38 Exemples dinstruments ES-MS ou ES-MS/MS ESI-Q-TOF Synapt with IMS (Waters) nanoESI-TOF (Waters) with Triversa nanomate (Advion) ESI-Q-TOF II (Waters) ESI-Q-TOF (Bruker)

39 Applications en ESI-MS Vérification de structure et de pureté de molécules naturelles ou synthétiques Contrôle du suivi dune molécule au cours du temps Détection et identification de modification Couplage LC-MS Complexes non covalents Informations structurales par MSMS

40 1- LESI permet de mesurer des masses très élevées par ce quelle génére des ions multichargés (plusieurs millions de Daltons). 2- LESI est très douce. On observe que les ions moléculaires qui ne fragmentent pas. 3- LESI permet lanalyse des petites molécules et les massifs isotopiques permettent de déterminer létat de charge des différents ions. 4- LESI est compatible avec le couplage LC-MS A retenir à propos de lionisation par électrospray (ESI):


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