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Chapitre 6 Techniques de purification des protéines 1.Isolement des protéines A. Choix dune source de protéines B. Techniques de solubilisation C. Stabilisation.

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1 Chapitre 6 Techniques de purification des protéines 1.Isolement des protéines A. Choix dune source de protéines B. Techniques de solubilisation C. Stabilisation des protéines D. Détection des protéines E. Stratégie générale de purification de protéines

2 2. Solubilité des protéines A. Influence de la concentration en sels B. Influence du pH 3. Separation par chromatographie A. Chromatographie par échange dions B. Chromatographie par filtration sur gel C. Chromatographie daffinité D. Autres techniques chromatographiques

3 4. Electrophorèse A. SDS-PAGE B. Focalisation isoélectrique 5. Ultracentrifugation A. Ultracentrifugation préparative

4 Purification des protéines Pourquoi purifier ? Etudier les propriétés dune protéine Déterminer sa séquence en acides aminés Déterminer sa structure tridimensionnelle Difficulté Les cellules contiennent généralement plus de 1000 types de protéines différentes. Chaque protéine a donc en moyenne une abondance inférieure à 1/1000 Solution Tirer profit des différences de propriétés physicochimiques et biochimiques des protéines: solubilité, taille, point isoélectrique, charge, hydrophobicité, affinité pour certains ligands

5 Ces techniques sont des outils de base de la biochimie et et beaucoup de ces techniques sont utilisées en routine pour des applications cliniques 1 ISOLEMENT DES PROTEINES Certaines protéines représentent la substance principale dune cellule, par exemple lhémoglobine dans les globules rouges. Dautres protéines, comme le répresseur de lopéron lactose dE. coli, se trouvent quà raison de quelques molécules par cellule. Les mêmes techniques sont utilis é es pour purifier ces deux prot é ines. Leur isolement et leur purification repr é sentent souvent des jours de travail pour obtenir quelques milligrams (mg) ou micrograms ( g) de la prot é ine d é sir é e

6 A. Choix dune source de protéines Les protéines qui assurent des fonctions identiques se retrouvent en général chez de nombreux organismes, par exemple les enzymes de la glycolyse Mais, on peut trouver différentes variantes dune même prot é ine dans diff é rents tissus du même organisme ou dans diff é rents compartiments de la même cellule, par exemple des isozymes Le choix doit tenir compte de crit è res tels que: possibilit é de se procurer facilement des quantit é s suffisantes du tissu d ou on veut isoler la prot é ine On utilise souvent des tissus d animaux tels que poulets, boeufs, porcs ou rats. On peut é galement partir de microorganismes comme E. coli ou la levure

7 A. Choix dune source de protéines.... Par clonage moléculaire, pratiquement nimporte quel gène codant une protéine peut être isol é de son organisme d origine et exprim é en grande quantit é (surexprim é ) dans un organisme appropri é mis en culture tel que E. coli ou la levure La prot é ine ainsi clon é e et surexprim é peut repr é senter jusqu à 30% des prot é ines totales de la cellule surproductrice Ceci facilite beaucoup l isolement et purification de la prot é ine clon é e

8 B. Techniques de solubilisation La méthode de lyse la plus simple appelé lyse osmotique, consiste à mettre les cellules dans un milieu hypotonique. Pour faciliter la rupture de cellules, on ajoute souvent un détergent non ionique comme le Triton ou le Tween Cette technique est sans effet avec les cellules qui ont une paroi cellulaire. Le lysozyme peut être utilisé pour digérer les parois bactériennes Dans beaucoup de cas, un traitement mécanique est nécessaire: broyage en présence de sable, lutilisation dun homogénéiseur, dune Presse de French ou dun sonicateur. Le lysat obtenu est ensuite centrifugé

9 Centrifugation différentielle

10 C. Stabilisation des protéines Les protéines sont facilement dénaturées à haute température et se dénaturent lentement à 25°C. La purification de protéines se fait normalement à 4°C Les cellules contiennent des protéases quon peut inactiver ou inhiber par des agents chimiques spécifiques Dautres précautions: éviter loxydation de résidus cystéines; éviter la contamination par des métaux lourds; garder la concentration saline dans la zone de stabilité de la protéine; empêcher la croissance des micro-organismes; é viter de faire mousser et garder une solution prot é ique sous forme concentr é e

11 D. Détection des protéines Lorsquon purifie une protéine, on doit pouvoir la mesurer quantitativement et spécifiquement. En conséquence, on doit disposer dune méthode de dosage spécifique a. Les dosages de protéines les plus simples sappliquent aux enzymes - dosage spectrophotométrique, fluorométrique ou radiochimique b. On peut détecter des protéines autres que des enzymes en tirant parti de leur propriété de se lier à des molécules spécifiques (ligands) par exemple des récepteurs

12 c. Les techniques immunochimiques sont très sensible et spécifiques. Ces méthodes utilisent des anticorps produites par le système immunitaire dun animal en réponse à linjection dune protéine étrangère (anticorps polyclonaux) On peut également obtenir des anticorps monoclonaux en fusionnant une cellule produisant lanticorps avec une cellule dun cancer du système immunitaire appelé myélome On détecte la protéine directement en la faisant précipiter avec ces anticorps ou indirectement par dosage immunoenzymatique appelé ELISA (enzyme- linked immunoabsorbent assay)

13 Substrate Anticorps primaire Enzyme Anticorps secondaire Echantillon contenant différents antigens Produit coloré Test immunoenzymatique (ELISA)

14 Leurs différentes propriétés physicochimiques et biochimiques sont mises à profit Charactéristiques Techniques Solubilité 1. Solubilisation/précipitation saline Charge ionique 1. Chromatographie par échange dions 2. Electrophorèse 3. Focalisation isoélectrique Caractère polaire 1. Chromatographie dadsorption 2. Chromatographie en phase inverse 3. Chromatographie par interactions hydrophobes E. Stratégie générale de purification des protéines

15 Leurs différentes propriétés physicochimiques et biochimiques sont mises à profit Charactéristiques Techniques Taille moléculaire 1. Dialyse et ultrafiltration 2. Electrophorèse en gel 3. Chromatographie par filtration sur gel Spécificité de liaison 1. Chromatographie daffinité E. Stratégie générale de purification des protéines

16 2 SOLUBILITE DES PROTEINES A. Influence de la concentration en sels La solubilité dune protéine à faible force ionique augmente généralement avec la concentration en sel, appelé salting in (solubilisation saline) Pour des forces ioniques élevées, la solubilité des protéines diminue, appelé salting out (précipitation saline)

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18 B. Influence du pH La solubilité dune protéine est au minimum quand pH = pI. Cette propriété est lorigine dune méthode de purification des protéines appelé précipitation isoélectrique

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20 3 SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE La solution de protéines dissout dans la phase mobile est filtrée à travers dune colonne constituée dun support solide poreux: la phase stationnaire Les interactions des différentes protéines avec la phase stationnaire ralentissent plus ou moins leur migration à travers le support Si la force de rétention est de nature ionique, la technique de séparation est appelée chromatographie par échange dions

21 A. Chromatographie par échange dions Dans le processus déchange dions, les ions liés électrostatiquement à un support insoluble et chimiquement inerte sont remplacés de manière réversible par des ions en solution: Résine + A - + Protéine - Résine + Protéine - + A -

22 Chromatographie sur échangeurs danions Principe : une protéine a - une charge positive aux pH < pI - une charge négative aux pH > pI Elle peut donc être retenue sur un échangeur de cations ou un échangeur danions, suivant le cas Elle peut alors être éluée par passage dun tampon contenant du sel en quantités croissantes Echangeur danions = gel porteur de charges fixes positives Echangeur de cations = gel porteur de charges fixes négatives

23 Chromatographie déchanges dions avec élution par paliers

24 Dispositif pour créer un gradient de concentration linéaire

25 B. Chromatographie par filtration sur gel Dans la chromatographie par filtration sur gel, appelée également chromatographie par exclusion ou par tamisage moléculaire, les protéines sont séparées selon leur taille et leur forme a. La plupart des gels sont constitués de dextran (Sephadex), dagarose ou de polyacrylamide La filtration sur gel est souvent utilisée pour dessaler une solution protéique. Ainsi, on peut éliminer le sulfate dammonium dune protéine qui a été précipitée par ce sel

26 Chromatographie par filtration sur gel

27 b. La chromatographie par filtration sur gel peut servir à estimer les masses moléculaires

28 c. La dialyse est une forme de filtration moléculaire La dialyse permet de séparer les molécules selon leur taille, en utilisant des membranes semiperméables dont les pores ont une taille inférieure aux macromolécules

29 C. Chromatographie daffinité Dans la chromatographie daffinité, un ligand qui se lie spécifiquement à la protéine est fixé par covalence à une matrice inerte et poreuse Quand une solution protéique traverse ce matériel, la protéine dintérêt se lie au ligand immobilis é, tandis que les autres sortent de la colonne. On peut r é cup é rer la prot é ine d é sir é e sous forme tr è s pure en modifiant les conditions d é lution de sorte que la prot é ine se d é tache de la matrice chromatographique

30 Chromatographie daffinité Principe : Repose sur la relative spécificité dinteraction dune protéine pour certains ligands Exemple : affinité de lhexokinase pour lATP La protéine sadsorbe sur un gel sur lequel le ligand est fixé de façon covalente Elle est ensuite éluée en lavant avec un milieu contenant du ligand non fixé (ou en augmentant la concentration en sels, ou en changeant le pH)

31 Ligand fixé à la matrice Protéine ayant de laffinité pour le ligand. Autres protéines

32 Purification de la nucléase de staphylocoque par chromatographie daffinité -le compose représenté en (b) a été lie par covalence à de lagarose activé par le CNBr

33 D. Autres techniques chromatographiques a. La chromatographie en phase inverse (RPC) Dans les protéines dénaturées, les cha î nes lat é rales non polaires se trouvent expos é es au solvant. Par cons é quent, les prot é ines é tablissent des interactions hydrophobes avec les groupes non polaires fix é s sur une matrice Les prot é ines sont é lu é es par une phase mobile contenant une forte concentration de solvant organique tel que l ac é tonitrile Dans la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse, des cha î nes paraffiniques sont fix é es sur des billes de silice

34 b. La chromatographie par interactions hydrophobes sépare les protéines natives en vertu de lhydrophobicité de surface Principe : Les protéines présentent des affinités variables pour les groupements hydrophobes Elles se lient donc avec une affinité variable à un gel porteur de groupements hydrophobes Elles peuvent en être éluées, soit en diminuant la concentration de sels, soit en augmentant la concentration dun solvant moins polaire que leau (éthylène glycol)

35 4 ELECTROPHORESE Séparation de solutés chargés par migration dans un champ électrique - la migration dépend: de la charge de la protéine de sa taille du support (gel plus ou moins réticulé, papier) -dans la focalisation isoélectrique (électrophorèse dans gradient de pH) migration dépend uniquement du pI -dans lélectrophorèse SDS-PAGE*, la vitesse de migration dépend - de la taille de sous-unité (protéine dénaturée) - du degré de réticulation du gel * Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

36 A. SDS-PAGE Le SDS se lie très fortement aux protéines en leur conférant une forme de bâtonnet. Les protéines lient environ une molécule de SDS pour deux résidus dacides aminés La forte charge négative apportée par le SDS masque la charge intrinsèque de la protéine, bien que le rapport e/m reste identique. Par conséquent, lélectrophorèse de protéines en gel de polyacrylamide contenant du SDS les sépare en fonction de leur masse moléculaire, par effect de filtration sur gel: SDS-PAGE

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38 SDS-PAGE

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40 Relation logarithmique entre la masse moléculaire dune protéine et sa mobilité électrophorétique relative en SDS-PAGE

41 Western blot = immunoempreinte Révélation dune protéine à laide dun anticorps spécifique

42 B. Focalisation isoélectrique Si un mélange de protéines est soumis à une électrophorèse dans une matrice ayant un gradient de pH et dont le pH augmente lentement de lanode vers la cathode, chaque protéine va migrer jusquà lendroit où le pH est égal à son point isoélectrique:

43 Electrophorèse sur gel en deux dimensions (électrophorèse 2D)

44 Le gradient de pH est obtenu en mélangeant des oligomères de faible mass ( Da) qui portent des groupes amino et carboxyliques aliphatiques (ampholytes) formant ainsi un éventail de points isoélectriques

45 5 ULTRACENTRIFUGATION Lultracentrifugeuse, mis au point par The Svedberg en 1923, peut atteindre des vitesses de rotation de rpm et permet la sédimentation de macromolécules. La masse dune particule peut être calcul é e à partir de son coefficient de sédimentation, analogue à la mobilité électrophorétique, en unités Svedberg (S)

46 A. Ultracentrifugation préparative Dans l'ultracentrifugation zonale, une suspension protéique est soigneusement déposée au-dessus d'un gradient de densité de saccharose. Au cours de la centrifugation, chaque particule traverse le gradient en fonction de son coefficient de sédimentation: Ultracentrifugation zonale - utilisé pour des complexes macromoléculaires, des particules et des fractions membranaires


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