La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire."— Transcription de la présentation:

1 Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire 7-8 septembre 2006 Faculté de Pharmacie, Marseille Roselyne GARNOTEL Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, CNRS UMR 6198, UFR Médecine, IFR 53 Biomolécules, Reims Biomolécules

2 INTRODUCTION

3 1. Recrutement 2. Adhésion 3. Diapédèse 4. Contact collagène/cellules sanguines(RGD) 5. Explosion respiratoire (DGGRYY sur 1 CB6) Libération de MMPs collagène I polynucléaireneutrophile ou monocyte cellules endothéliales membrane basale ou collagène IV COMPARTIMENT INTRAVASCULAIRE MATRICE EXTRACELLULAIRE ± MODIFIEE Interactions collagènes/cellules sanguines

4 télopeptide N-terminaltélopeptide C-terminal zone hélicoïdale ( triple hélice ) Le collagène de type I DGGRYY RGD Demi-vie : 15 ans

5 Les cellules inflammatoires Les polynucléaires neutrophiles : principales cellules de défense de lorganisme sont impliqués dans les réponses inflammatoires, la phagocytose bactérienne… Les monocytes : sont impliqués dans les réponses inflammatoires et la production de cytokines régulatrices sont transformés en macrophages tissulaires qui sont les cellules pivot de linflammation chronique sont en contact du collagène I, le composant majoritaire de lespace sous-endothélial

6 Famille des intégrines Structure des intégrines 2 Les récepteurs de type intégrine

7 p22 phox gp91 phox p21 rac GDP GDI p67 phox p47 phox p40 phox NADPH NADP + + H + O2O2 O2-O2- CYTOSOL MEMBRANE PLASMIQUE p21 rac GTP GDI p47 phox p67 phox p40 phox P P P La NADPH oxydase

8 - dégradent au moins un des composants de la matrice extracellulaire - sont synthétisées sous forme latente appelée proMMP - nécessitent une activation extracellulaire par clivage du prodomaine - contiennent un site de liaison au zinc dans le domaine catalytique - sont inhibées par les TIMPs (inhibiteurs spécifiques tissulaires) -sont divisées en familles dont une est celle des gélatinases (A et B, ou MMP-2 et MMP-9 ) Les métalloprotéinases matricielles

9 peptide signal pro-peptide domaine catalytique Structure primaire des gélatinases région charnière domaine hémopexine domaine fibronectine type II Zn 2+ Les métalloprotéinases matricielles

10 t-PA u-PA plasminogène plasmine pro-collagénase (proMMP-1) pro-stromélysine (proMMP-3) Stomélysine (MMP3) collagénase (MMP1) gélatinase B (MMP-9) pro-gélatinase B (proMMP-9) TIMPs 2-macroglobuline PAIs La cascade protéolytique

11 - fait partie de la famille des Sérine protéinases. - contient un domaine analogue à lEGF, un domaine « kringle » et un domaine catalytique. - se fixe à un récepteur membranaire (uPAR). EGFKringleprotéinase N C S-S N C u-PA de faible MM (30 kDa) EGFKringleprotéinase S-S N C Simple chaîne (sc-uPA) Double chaîne (tc-uPA) u-PA de haute MM (55 kDa) Lu-PA (urokinase type-Plasminogen Activator)

12 Interactions entre le collagène de type I et cellules inflammatoires

13 Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I

14 Adhésion des polynucléaires au collagène de type I Activation des polynucléaires au contact du collagène I avec libération de radicaux libres oxygénés exocytose des granules Implication de lintégrine LFA-1 ou L 2 ou CD11a/CD18 Mise en évidence des voies de transduction impliquées GARNOTEL, R, MONBOISSE, J.C., RANDOUX, A., HAYE, B., BOREL, J.P. The binding of type I collagen to LFA-1 integrin triggers the respiratory burst of human polymorphonuclear neutrophils. Role of calcium signalling and tyrosine phosphorylation of LFA-1. J. Biol. Chem., 1995, 270, CAS pepsiné CAS

15 Interactions entre les monocytes et le collagène de type I

16 Adhésion des monocytes au collagène de type I Activation des monocytes au contact du collagène I avec libération de radicaux libres oxygénés Implication de lintégrine gp150/95ou X 2 GARNOTEL, R., RITTIE, L., POITEVIN, S., MONBOISSE, J.C., NGUYEN, P., MAQUART, F.X., RANDOUX, A., GILLERY, P. Human blood monocytes interact with type I collagen through x 2 integrin (CD11c-CD18, gp ). J. Immunol., 2000, 164, MMP uPA cytokines uPA Plasminogène -----> plasmine pro-MMP > MMP9

17 Time (h) PlasticType I collagen MMP-9 Pro-MMP9 LMW uPA Time (h) PlasticType I collagen LMW uPA HMW uPA Libération de pro-MMP9 et duPA Activation de la pro-MMP9 en MMP9 TNF - IL-1 IL-6 Libération dIL-6, IL-1 et TNF-

18 Plast Coll 1 h2 h 3 h Hetero-dimers Homo-dimers 123 C PD NACU Pro-MMP9 Control PDTC 100 µM NAC 10 mM Curcumin 50 µM HMW uPA LMW uPA Implication de NF- B

19 Les principales modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire

20 Remaniements moléculaires Altérations structurales et fonctionnelles des protéines Mécanismes de maturation / vieillissement impliqués en pathologie Fixation non enzymatique de métabolites simples Oses et dérivés : glycation Oses et dérivés : glycation Urée et dérivés : carbamylation Dérivés lipidiques ou de glycation : oxydation Dérivés lipidiques ou de glycation : oxydation Modifications post-traductionnelles des proteines

21 Pathologies « post-traductionnelles » Diabète Glycation Oxydation Insuffisance rénale Athérosclérose Oxydation Carbamylation Glycation Oxydation Vieillissement physiologique

22 Glycation / glycoxydation non enzymatique Réaction chimique entre : groupement NH 2 ( -NH 2 terminal ou -NH 2 -lysine dune protéine ose simple (glucose) Réaction générale : In vitro : « brunissement des protéines » « réaction de Maillard », 1912 In vivo : diabète (1960), vieillissement physiologique et autres pathologies (1980) toutes les protéines Réaction spontanée, irréversible et cumulative (durée de vie)

23 Produits dAmadori Oxydations, Clivages, Pontages Produits intermédiaires (aldéhydes réactifs) Produits avancés de la glycation («advanced glycation end products» ou «AGE» ou «Produits de Maillard») Pontages, Altérations….. Glycation + Oxydation = Glycoxydation Base de Schiff Glucose + Protéine Glycation / glycoxydation

24 La carbamylation est une modification post-traductionnelle non enzymatique des protéines, par fixation dacide isocyanique provenant de la décomposition de lurée NH 2 C O NH UréeCyanate C - N- N- N- NO C HNO R NH 2 + N C O H R AcideIsocyaniqueProtéine (Lysine -NH 2 ) Protéine carbamylée (Homocitrulline) Carbamylation

25 Augmentation dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) Perte de la fonction des protéines Impliquée dans des réactions délétères LDL carbamylées (Athérosclérose au cours de l'IRC) Collagène carbamylé (Athérosclérose, inflammation et infection au cours de l'IRC) Carbamylation des protéines

26 Les fonctions des cellules sont modulées par des stimuli provenant dautres types cellulaires, mais aussi dinteractions spécifiques avec les protéines de la matrice extracellulaire (MEC). Les protéines de la MEC sont particulièrement sujettes aux modifications post-traductionnelles, en raison de leur longue durée de vie. Les interactions cellules – matrice ne peuvent se concevoir sans prendre en compte ces modifications. Rôle central de la matrice extracellulaire en pathologie

27 Interactions entre le collagène de type I modifié et cellules inflammatoires

28 La carbamylation du collagène de type I

29

30 Collagène de type I (tendons de queues de rat) incubé pendant 2, 6 et 24 heures à 37°C dans un tampon phosphate 0,15 M (pH 7,4) contenant 0,1 M KCNO 1 (I) - 2 (I) - T2hC2hT6hC6hT24hC24h Taux de carbamylation du collagène I Hydrolyse acide (HCl 6 M – 18 h à 110°C) Analyse de la composition en acides aminés1116 Carb 24h 423 Carb 6h 225 Carb 2h 027Témoin HomocitrullineLysine Résultats exprimés en nombre de résidus pour 1000 Modifications de la composition en acides aminés et de la migration électrophorétique Mobilité électrophorétique SDS-PAGE 5%

31 Témoin 10 µm Carb 2h 10 µm Carb 24h 10 µm Carb 6h 10 µm Modifications de laspect du réseau de fibres formé par le collagène carbamylé

32 1 (CB3) - 1 (CB3) - 1 (CB6) - 1 (CB6) - 1 (CB7-8) - 1 (CB7-8) - 2 (CB4) - 2 (CB4) - 2 (CB3-5) - 2 (CB3-5) - Clivage du collagène témoin ou carbamylé 6 h par le bromure de cyanogène (CNBr) Analyse des peptides par SDS-PAGE 12,5 % (Mono- et Bidimensionnelle) Témoin Carb 6h Electrophorèse 1DElectrophorèse Bidimensionnelle 1 (CB6) - 1 (CB6) - Témoin Carb 6h pHi : 3 10 Mise en évidence de la carbamylation du peptide 1 CB6

33 Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I carbamylé

34 Réduction du NBT (Abs 560 nm) Chaque puits (32mm²) est recouvert par 25 µg de collagène témoin ou carbamylé Incubation des PNN pendant 2 heures à 37°C – Réduction intracellulaire du NBT (Abs 560 nm) Plastique Coll Témoin + fMLP M Coll Témoin Coll Carb 2h Coll Carb 6h Coll Carb 24h Inhibition de lactivation des PNN par le collagène I carbamylé

35 1 (CB6) 1 (CB6) SDS-PAGE 12,5%ADHESIONACTIVATION MMTémoin Carb 6h Pepsiné Coloration au Bleu Coomasie R250 Témoin Carb 6h Pepsiné Incubation : 30 min Western Blot Anti-CD11a, CD11b et CD18 Témoin Carb 6h Pepsiné Incubation : 1h Réduction du NBT La carbamylation du peptide 1 CB6 entraîne linhibition de lactivation des polynucléaires

36 Collagène Sans anticorps IgG1 Contrôle Anti-CD11aAnti-CD18 Collagène Témoin 0,182 ± 0,014 0,171 ± 0,008 0,110 ± 0,012 ** 0,110 ± 0,012 ** 0,047 ± 0,021 ** 0,047 ± 0,021 ** Collagène Carbamylé 2h 0,196 ± 0,037 0,183 ± 0,033 NS 0,183 ± 0,033 NS 0,133 ± 0,014 * 0,133 ± 0,014 * 0,035 ± 0,030 ** 0,035 ± 0,030 ** Collagène Carbamylé 6h 0,178 ± 0,023 0,160 ± 0,026 NS 0,160 ± 0,026 NS 0,119 ± 0,024 ** 0,119 ± 0,024 ** 0,039 ± 0,027 ** 0,039 ± 0,027 ** Collagène Carbamylé 24h 0,165 ± 0,012 0,162 ± 0,025 NS 0,162 ± 0,025 NS 0,118 ± 0,027 * 0,118 ± 0,027 * 0,012 ± 0,017 ** 0,012 ± 0,017 ** *: p<0,05 ; ** : p<0,01 Mesure de ladhésion des PNN au collagène carbamylé en présence danticorps anti-LFA-1 (coloration au violet cristal) Interaction des polynucléaires avec le collagène carbamylé via LFA-1 (CD11a/CD18)

37 Etude de la phosphorylation de p 125 FAK suite à un contact entre PNN et collagène carbamylé par Western Blot p 125 FAK p 125 FAK P [Y 397 ] --Témoin Carb 24h Temps dincubation (min) : 0222 Inhibition de la phosphorylation de p 125 FAK suite au contact des polynucléaires avec le collagène carbamylé

38 JAISSON, S., LORIMIER, S., RICARD-BLUM, S., SOCKALINGUM, G.D., DELEVALLEE-FORTE, C., KEGELAER, G., MANFAIT, M., GARNOTEL, R., GILLERY, P. Impact of carbamylation on type I collagen conformational structure and its ability to activate human Polymorphonuclear neutrophils. Chem. Biol., 2006, 13, CAS 2 µm CAS carbamylé 2 µm

39 Interactions entre les monocytes et le collagène de type I carbamylé

40 Carbamylation du collagène et monocytes Carbamylation du collagène modifie les fonctions biologiques des cellules inflammatoires GARNOTEL, R., SABBAH, N., JAISSON, S., GILLERY, P. Enhanced activation of and increased production of matrix metaloproteinase-9 by human blood monocytes upon adhering to carbamylated collagen. FEBS Letters, 2004, 563,

41 CONCLUSION

42 +/- Quel(s) site(s) ? Quelle(s) modification(s) ? Protéine Quel(s) mécanisme(s) ? Quel(s) traitement(s) ? +/- Cellules Quelle(s) fonction(s) ?

43 IBCP - CNRS UMR Lyon Pr. Sylvie Ricard-Blum Unité Médian - CNRS UMR Reims Pr. Michel Manfait - Dr. Ganesh Sockalingum - Dr. Grégory Kegelaer Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire - CNRS UMR 6198 – Matrice Extracellulaire et Régulations Cellulaires - Reims Pr. Ph. GILLERY – Pr. F.X. MAQUART – Dr. S. JAISSON – Dr. C. DELEVALLEE-FORTE – Dr. N. SABBAH Dr. F. TOURE – Dr. A. SZCZYHEL Centre détude des Biomatériaux et Interfaces – INSERM ERM Reims Dr. S. LORIMIER


Télécharger ppt "Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire."

Présentations similaires


Annonces Google