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Sélection du Top Spermatozoïde Université de Liège CPMA CHR de la Citadelle S. Perrier dHauterive,MD, PhD, M. Dubois, O. Gaspard, F. Thonon, C. Jouan,

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1 Sélection du Top Spermatozoïde Université de Liège CPMA CHR de la Citadelle S. Perrier dHauterive,MD, PhD, M. Dubois, O. Gaspard, F. Thonon, C. Jouan, S. Ravet, P. Ruggeri, V. Gridelet and J-M Foidart XII èmes Journées Liégeoises de Gynécologie-Obstétrique septembre 2009

2 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Reproduction: histoire de rencontres Fécondation: rencontre des gamètes – Spermatozoïde normal: le top spermatozoïde –Ovule mature: le top ovocyte embryon compétent Implantation: rencontre embryon et endomètre –Embryon Développement embryonnaire précoce –Endomètre maternel fenêtre de réceptivité

3 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Sperme Fonctions: 1. Donner une population de spermatozoïdes aptes à féconder lovule spermogramme 2. Aptitude pour le gamète de permettre le développement dune embryon normal et sain apte à simplanter dégats ADN, MSOME

4 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Progrès en andrologie: focus quasi exclusif sur le fécondation de lovule: –ICSI (1992): Perte de la sélection naturelle: injection de spermato immatures, immobiles, morpho pathologique ou ADN très fragmenté avec certain succès (Ogura et al. 2005): !!tolérance de la fécondation!! –conséquences de la fécondation des ovocytes avec des spermatozoïdes à lADN endommagé ne sont pas connues avec certitude Evaluation du sperme

5 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Dégats de lADN: fragmentation/décondensation Age, erreurs de réplication Exposition aux xénobiotiques: thérapeutique, occupationnel ou mode de vie ( pesticides, tabac, styrène, hydrocarbures, polluants, …) Infections Exposition chaleur Irradiations électromagnétiques: téléphones mobiles !! (De Iuliis et al., 2009) Spermato défecteux: - protamination défectueuse: décondensation ADN - Apoptose défecteuse (ROS) -résidus cytoplasmiques (ROS) Stress oxydatif Clivage lié endonucléase Erreurs dimprinting Dégâts ADN Réparation ADN Développement aN Echec implantation FC aN chez la descendance Embryon normal

6 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Dégats de lADN Description dassociation de dégats de lADN avec: –Réduction taux de G en fécondation in vitro (34%vs19%), altération développement embryonnaire, FC, faible fertilité en fertilité naturelle ou assistée (Sakkas 1998, Aitken 2001, Duran 2002, Morris 2002, Benchaib 2003, Loft 2003, Virro 2004, Kruger 2004, Tesarik 2006, Libman 2006, ) –Incidence élevée de pathologies dans la descendance: infertilité, cancer, maladie génétique ( Apert) mais R faible pour G1…Conséquences sur les générations futures??

7 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Dégats de lADN spermatique Physiologiquement et dans certaines limites: mécanismes de réparation de lADN endommagé par lovocyte (Shimura 2002), mais parfois défectueux: –Dégats étendus, déficits ovocytaires (âge, culture IV, …) (Zheng 2005) –Réparation aberrante (Aitken 1999) Frydman et al. 2008: bonne réserve ovocytaire ne prévient pas la réduction des TG associée au sperme à fragmentation élevée.

8 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Fragmentation de lADN Définition : cassures de lADN double brin: particulièrement fréquentes dans la population masculine subfertile (Irvine et al. 2000) Ne constitue pas une mutation mais est un changement pro-mutagène qui peut générer des mutations chez la descendance suite à une réparation inadéquate ou défectueuse Impact: principalement sur les grossesses et fausses couches, peu au niveau du développement embryonnaire précoce, y compris la fécondation

9 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Fragmentation de lADN Comparaison hommes fertiles (HF) et infertiles (HI): pas de frag dans sperme à morpho normale chez HF, mais bien chez HI ! (Avendano et al. 2008) Corrélation entre réduction de la numération, motilité et de la morphologie avec le niveau élevé de fragmentation MAIS…même avec un spermocytogramme normal, un index de Frag >20- 30% peut être observé (Erenpreiss et al. 2008, Moskovtsev et al., 2009, Varghese et al., 2009) Frag >30%: IIU inutiles faire ICSI demblée?: capacitation en F in vivo ou FIV class: ROS et aggravation frag/ICSI: accès direct à la réparation ovocytaire mais FIV: cumulus= meilleure sélection! (Bungum et al. 2007)

10 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Dégats de lADN spermatique Corrélation avec anomalies chromosomiques ( aneuploïdies ) et fragmentation de lADN spermatique dans les cas de tératospermie sévère (Tang et al., 2009) Fragmentation: corrélation avec lâge paternel … (Belloc et al., 2008, Quant et al., 2009)

11 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive TUNEL assay T erminal deoxynucleotidyl transferase ( T dT) mediated deoxyuridine triphosphate (d U TP)-fluorescein N ick- E nd L abelling assay 1.Incorporation de nucléotides biotinylés à laide de la terminal deoxynucleotidyl transferase au niveau des cassures de lAND Ajout dun anticorps anti-biotine couplé à FITC 3.Evaluation de la proportion de spermatozoïdes fluorescents (microscope fluo x100 sous huile ou FACS) Dapi (bleu) pour coloration noyaux cellulaires et FITC (vert) pour fragmentation Résultats: < 20%: normal 21-30% fragmentation augmentée: sans incidence 31-40% fragmentation augmentée: à surveiller!!! 40% fragmentation très augmentée: TT ! Exclure inflammation ou infection: ROS et Frag

12 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Décondensation ADN Cellule somatique : histones Spermatozoïdes : protamines –Condensation plus importante de lADN –Protection de lADN contre diverses agression, dont certaines responsables de la fragmentation –Ce nest pas la décondensation en elle-même qui diminue la fertilité (ROSI) Louverture des ponts disulfures interbrins des protamines (P2), conduit à décondensation de lADN: –Impact sur le développement embryonnaire précoce –Si > 28%: pas de grossesse –Pas de résolution du problème via lICSI (>< fragmentation: ICSI peut parfois améliorer le développement embryonnaire

13 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Décondensation ADN Etude de la dispersion de lADN effectuée par la technique de la coloration à la chromomycine et lecture in situ –Chromomycine A3 est fluorescente et entre en compétition avec la protamine au niveau des sites de fixation sur lADN –Un décondensation >30% est un marqueur de mauvaise qualité de lintégrité de la double hélice de lADN: peut expliquer échecs de fécondation et/ou développement E précoce= CI TT anti-oxydant! Rouge: normal Jaune: décondensé

14 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Stratégie thérapeutique Fragmentation isolée > 30% : antioxydants Vit C (400 mg), vit E (400 mg), bétacarotène (18mg), Zinc (500 µmol), Sélénium (1µmol) Décondensation isolée >30% : Traitement par Zinc et vitamines B6, B9, B12 Fragmentation et décondensation entre 20 et 30%: Zn, vit B et tocophérol Si les deux valeurs sont élevées (contre indication traitement antioxydants si décondensation élevée) : privilégier le TT de la décondensation: Zn et vit B (et prévoir ICSI) Les deux tests: cassures de lADN et qualité de la condensation doivent être réalisés avant tout traitement anti-oxydant

15 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Microscopie électronique: à180000X - fixation! - purement - coût!!!! Analyse fine de la morphologie MSOME: à X - pas de fixation! - diagnostique et thérapeutique!!

16 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive MSOME Analyse fine de la tête spermatique (Bartoov, 2002) –Forme: Ovale, lisse, symétrique –Taille évaluée sur 100 spz normaux: 4,75 + 0,28µm sur 3,28 + 0,20 µm –Chromatine: Normale si 0 ou 1 petite vacuole Anormale: si 1 ou plusieurs vacuoles occupent plus de 4% de laire nucléaire Corrélation positive avec critères strictes de Kruger : (Oliveira, 2009) –mais % formes normales Kruger (9%)> MSOME (3;3%)

17 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Noyau spermatique 17 vacuoles Vacuoles:petites lacunes claires. Bedford et al,1973 (x 46000) Bisson et David, La structure et/ou la composition de la chromatine des noyaux des spermatozoïdes humains est très variable. -La chromatine granuleuse peu condensée traduit une immaturité nucléaire -des vacuoles nucléaires de taille et de localisation variables sont régulièrement observées en MET

18 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Noyau spermatique Signification des larges vacuoles nucléaires des spermatozoïdes? –Fragmentation dans spermatozoïdes à larges vacuoles (30%) > spermato Nx (16%) (Franco et al., 2008) –Décondensation plus élevée dans spermatozoïdes vacuolés (Cohen-Bacrie, 2008) –Spermatozoïdes de morphologie normale: meilleures fonctions mitochondriales, structure de la chromatine, et moins daneuploïdes… Dautant plus si pas de vacuoles (Foresta et al., 2008)

19 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive LICSI ICSI: –Injection intra-cytoplasmique du spermatozoïde –2 étapes: Éliminer les cellules de granulosa injection de lentièreté du spermatozoïde dans le cytoplasme de lovocyte

20 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive ICSI et morphologie: Anomalies de la majorité des têtes spermatiques: ne donnent pas ou peu de grossesses :macrocéphalie, globozoospermie, 0% de têtes normales Pas de relation entre le % de formes atypiques et les résultats de lICSI( car choix du spermatozoïde le plus normal possible ) Le taux de succès de lICSI semble néanmoins dépendre de laspect morphologique du spermatozoïde injecté De Vos et al., 2003: –morphologie du spermatozoïde injecté en ICSI: influence sur le taux de fécondation, la morphologie embryonnaire(sur 662 cycles) et les taux de grossesses(sur 1667 cycles). Présélection du spz=étape cruciale pour le succès de lICSI= IMSI

21 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive LIMSI Microscope inversé avec condensateur de NormaskiMicroscope inversé avec condensateur de Normaski Micromanipulateur automatiséMicromanipulateur automatisé Objectif 100X en immersion sous huileObjectif 100X en immersion sous huile Boîtes en fond de verreBoîtes en fond de verre CameraCamera Grossissement total = gross. du microscope (150x) x gross.du coupleur vidéo (0,99x) x gross. de la vidéo (44,45x) = 6600xGrossissement total = gross. du microscope (150x) x gross.du coupleur vidéo (0,99x) x gross. de la vidéo (44,45x) = 6600x

22 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive IMSI La microinjection de spermatozoïdes avec une forme normale mais avec de larges vacuoles affecte les TG en ICSI et augmente les FC (Berkovitz, 2006, Antinori, 2008, Junca et al., 2009) Impact de ces vacuoles sur le développement embryonnaire? –J3: Non observable: peu de relation avec observation morphologique de lembryon (Berkovitz et al., 2006) –J5: Si 1 grosse vacuole ou plus de deux petites vacuoles: blastulation (Vanderzwalmen et al. 2008)

23 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive IMSI X 300 X Intra-cytoplasmic of morphologically selected sperm injection

24 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive IMSI: chromatine normale Pas de vacuole Une petite vacuole

25 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive IMSI Têtes spermatiques avec vacuoles de tailles différentes

26 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive IMSI: chromatine anormale X 300 X 6600

27 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Indications: Frag/décondensation/IMSI Echecs dIIU: décision FIV ou ICSI? Infertilités idiopathiques Échecs dimplantation en FIV/ICSI Tératos sévères < 1-6% (David) Fragmentations élevées (>30%) Fausses-couches itératives Pas encore vraiment codifiées

28 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Conclusions Succès de limplantation embryonnaire: conditionné par linteraction de gamètes au top: –Qualité et intégrité du spermatozoïde –Qualité de lovocyte…qui sera ou non capable de pallier les déficits éventuels, dassurer le succès du développement embryonnaire précoce Embryon compétent…pour dialoguer avec un endomètre qui doit être réceptif

29 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Merci…

30 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Le sperme- le spermatozoïde Spermatozoïdes : 5% du volume du sperme Vésicules séminales : plasma séminal (40-60% du vol spermatique-alcalin) Prostate : sécrétion constitue 10-30% du volume spermatique: protection et amélioration des fonctions spermatiques (Zinc, phosphatases acides, PSA qui liquéfie léjaculat) (acide) Glandes de Cowper : contribuent à 2-5% du volume: neutralisation acidité urine et lubrification urètre. Sperme Spermogramme Morphologie Aspect : opalescent ± opaque; Viscosité: < 2 cm Volume : 2 à 7 ml ; pH: 7,2 et 8 ( 8 = atteinte de la prostate) Numération: /ml (oligozoospermie < /ml) Mobilité (OMS): Critère de type de mouvement : a, b, c ou d. N: a>25%, A+B: 50% Vitalité: >60 % (coloration vitale éosine / nigrosine des SPZ morts (>50%: Nécrozoospermie) OMS: analyse sur 200 spermatozoïdes après fixation et coloration (papanicolaou) Plusieurs critères: David (N >30%) ou Kruger (critères stricts) N>14% Analyse de la morphologie des spermatozoïdes: anomalies de tête, de pièce intermédiaire, de flagelle, gouttelettes cytoplasmiques

31 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive ICSI et morphologie: De Vos et al., 2003: Linjection de spermatozoïdes anormaux saccompagne: –Dune baisse du taux de fécondation:60,7% versus 71,7% –Daucune différence dans la morphologie des embryons observés à J2 ou J3 –Dune baisse du taux de grossesse:20,2% versus 36,7% –Dune baisse du taux dimplantation :9,6% versus 18,7%

32 XII e JLGO 2009 Dr S. Perrier dHauterive Fragmentation: indications Pas encore codifiées… –Echec dICSI: échec implantation chez femme jeune –FC/échecs implantation itératifs –Infertilité idiopathique: avant PMA: choix IIU vs FIV/ICSI?


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