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TP 6 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs enzymatiques.

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1 TP 6 Dosage de la tyrosinase et influence des effecteurs enzymatiques.

2 1. Contacts Contact 1. Ron attend patiemment que passent les 18 minutes séparant lenvoie de son message à larrivée de la réponse. Enfin, la petite voix enfantine résonne dans ses écouteurs. -- Papa, tout ce passe bien ? -- Oui, mon chou. Nous avons dépassé lorbite de Mars. Nous avons effectués presque les deux tiers du trajet pour Jupiter. -- Tu as pu la voir ? -- Nous sommes passés à des millions de kilomètres. Par contre nous approchons de Vesta, dans la Ceinture interne. Jembarque dans le Héra dans quelques heures avec Ripley et John. Ripley est furieuse de ne pas avoir été désignée comme chef de lexpédition alors quelle est la plus gradée et la plus compétente. Cest John le chef !. -- Les journaux ont encore parlé delle et Eva. Tu crois quelles iront en prison pour détraqués sexuels? Elles sont comment ? -- Tu sais, depuis les réformes morales, les femmes sont séparées des hommes dans le vaisseau. Je ne les ai pas vues en six mois de voyage. Je vais faire la connaissance de Ripley au cours de cette mission. -- Mais toi, tu es un néo-templier, ta moralité est irréprochable. -- Les templiers nont pas un grand pouvoir dans la société moderne. Cela ne fait que quelques années que le pape à réhabilité lordre. Nous navons pas reconstitué lorganisation de lépoque ancienne. Nous ne pesons pas encore très lourd face aux Talibans-chrétiens. Quand je pense que la papauté, malgré ses réticences face à tout syncrétisme, avait donné son aval pour la création de ce mouvement religieux fusionnant Islam et christianisme. Rome pensait quil drainerait les musulmans occidentaux dans les rangs de léglise. Ca a été un mauvais calcul. -- Tu ne te sens pas trop seul, là-haut ? -- Le signal clignote ! Mon temps de communication est achevé. La prochaine fois que je tappellerai, je serais revenu de Vesta.

3 1. Contacts Contact Contact 2. Ripley a les yeux rivés sur lécran de contrôle. Le point quétait Vesta est devenu une tâche qui occupe la presque totalité de lécran. Elle parviendrait même à oublier la présence de lhorripilant J.M. si celui-ci cessait ses remarques stériles. Encore un médiocre dont le titre de chef dexpédition a tourné la tête. -- Combien de temps avant contact ? -- 7 minutes ! Cest affiché dans ce cadran. Et maintenant pourrais-tu avoir lamabilité de me laisser me concentrer ? -- Je naime pas ton ton, pilote ! Cest moi qui commande, ici ?. -- Nous savons tous ici pourquoi toi, simple mécanicien, as été choisi à ma place. Alors maintenant, tais-toi ! Ripley manipule les commandes avec douceur. Les rétrofusées crachent leurs panaches de gaz dans le vide de lespace. Le module sincline. -- Mise en orbite réussie ! Ron, tu peux envoyer la sonde. Le géologue sactive sur lécran tactile. Le petit appareil se détache de lHera et descend vers lastéroïde. Ripley suit sa trajectoire sur son écran. Elle le voit se poser dans un tourbillon de poussière.

4 1. Contacts. -- Contact ! Ripley se laisse aller en arrière contre le dossier de son siège. Cette grosse brute de Ron la prend dans ses bras et la comprime contre lui. -- Nous avons 48 heures pour effectuer les prélèvements. Ensuite retour au Junon Contact 2.

5 1. Contacts Contact 2. Ripley sursaute. Une main sest posé lourdement sur son épaule. -- Ron, je tai déjà demandé darrêter de faire ça. Je vais devenir cardiaque. -- Je croyais que cétait par dégoût des hommes, dit-il en riant. -- Quand on voit ta sale g... on doute que tu en sois un ! -- Cest pas ma tête quil faut regarder pour le savoir. Mais je suis bête, tu ne sais pas à quoi ça ressemble. Ripley envoie violemment sa main dans son entre-jambe. Ron grimace sous la douleur. -- Je cherche, je cherche, mais je ne trouve rien ! -- Je me rends. De nous deux, cest toi le vrai mec ! Tous deux se mettent à rire. Ripley passe sa main sur la joue de Ron. -- Je suis bien avec toi, Ron. Tu ne me juges pas. Tu me considères comme ton égale. Cela fait longtemps que je nai pas ressenti ça avec un homme. Quand nous retournerons sur le Junon, nous serons à nouveau séparés. -- Tu retrouveras Eva. Sa tronche vaut mieux que la mienne. -- Tu as le même cœur quelle. Tendre et immense comme lunivers. -- Fais gaffe, tu me fais une déclaration damour. Si J.M. entendait ça Il serait jaloux tu veux dire ? Lappareil se met à bipper. -- Voici les premiers résultats des prélèvements. Elle siffle entre ses dents. -- Il faut appeler Angie ! 1.3. Contact 3.

6 1. Contacts.2. Situation des prélèvements. -- Comment ça va, ma belle, dit la voix dans le haut-parleur ? -- Bien, à part que je suis collée par une espèce dours qui sent la transpiration. -- Tu es dans ton élément, alors. Quest-ce que ça donne ces échantillons ? La sonde a rapporté 3 échantillons provenant de 3 zones de Vesta. Ce sont 3 formations géologiques très différentes. Léchantillon A provient de la cheminée dun ancien volcan. Léchantillon B a été recueilli sur les pentes dun « pic » qui résulte sans doute de limpact dun astéroïde de grande taille au pôle sud. Léchantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques dimpacts de météorites Contact 3.

7 2. Situation des prélèvements. -- Je les ai passés au spectromètre de masse. Jai trouvé des traces de huit acides aminés. Ce nest pas surprenant en soi, mais compare les trois profils et dis-moi ce que tu en penses. Je tai envoyé les résultats. -- Je les ai bien reçus. Léchantillon A provient de la cheminée dun ancien volcan. Léchantillon B a été recueilli sur les pentes dun « pic » qui résulte sans doute de limpact dun astéroïde de grande taille au pôle sud. Léchantillon C a été ramassé sur la plaine équatoriale. Celle-ci présente de nombreuses marques dimpacts de météorites. -- Tu penses la même chose que moi ? -- Soit, le contexte géologique de la cheminée du volcan perturbe la synthèse non organique des acides aminés, soit nous sommes en présence dune activité tyrosinase. Il va falloir que tu testes tout ça avant de revenir. -- Je ne suis pas scientifique, moi ! -- Ron va taider. Nest-ce pas, Ron ? -- Je suis à vos ordres, mes toutes belles ! Pourquoi ces résultats impliquent-ils les recherches qui suivent?

8 2. Situation des prélèvements.3. Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- Cest quoi cette tyrosinase ? -- Cest une enzyme qui catalyse la formation des pigments dans les mélanocytes de la peau et les follicules pileux. On lappelle tyrosinase car la première étape consiste en la transformation de la tyrosine. Elle est aussi présente chez les végétaux, mais on ne sait pas trop à quoi elle sert. Elle provoque le brunissement des fruits et des légumes en présence de dioxygène. -- Si nous mettons en évidence une activité tyrosinase, nous aurons démontré quil existe un métabolisme complexe sur cette planète naine. -- Et la présence de vie ? -- Métabolisme ne veut pas dire nécessairement vie. Mais cest une première étape. -- Angie ? Tu me reçois ? -- Fort et clair ! Jai étudié les données que tu mas envoyées. Je suis de ton avis, il faut caractériser cette activité tyrosinase, si elle existe. Pour plus de sécurité, tu vas employer plusieurs méthodes de dosage.

9 3. Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- La méthode la plus simple est celle qui utilise le 4MC. Elle se base sur le principe que la tyrosinase est une enzyme relativement peu spécifique. Elle reconnaît plusieurs substrats différents qui possèdent une analogie de structure avec les 2-diphénol. Elle catalyse la réaction ci-contre: 3.1. Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- Le 4 Méthyl catéchol (4 MC) correspond à cette catégorie. Lorsquil subit la réaction, il donne un produit coloré, la quinone:

10 3. Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- Ripley ? Tu vas commencer par une cinétique pour tester la valeur de dilution de lextrait. Tu prépares le mélange réactionnel : - 1,5 mL de tampon acétate - 1 mL de 4 MC à 5 mmol.L-1 - 2,8 mL d'eau Tu ajoutes 0,2 mL d'extrait à t = 0 s et tu notes l'absorbance à 400 nm à t = 15 s et t = 135 s. Si cette dernière est comprise entre 0,8 et 1,2 cest bon. Tu peux lutiliser. Si elle est supérieure, tu le dilueras et tu recommenceras le test. -- Je teste les 3 échantillons ? -- Non, prends celui qui est le plus pertinent Cinétique préliminaire. -- Ensuite, tu laisses la réaction aller à son terme. Lorsque l'absorbance ne varie plus, tu notes labsorbance et tu évalues la valeur de.quinone. Déterminer léchantillon à tester ! Déterminer et justifier la méthode de calcul !

11 3. Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- Pour la détermination des paramètres, tu suis les instructions du tableau. Tu utilises les données de la cinétique pour choisir une dilution adéquate de lextrait Détermination des paramètres enzymatiques. Vérifier que la cinétique est linéaire entre 15 et 135 s Cinétique préliminaire. 0IIIIIIIV Tampon acétate (µL)550 4MC (à 5 mmol.L -1 ) (µL) pré-incubation à 37°C directement dans une micro-cuve. H2OH2O qsp 2 mL (après addition de lextrait) Extrait A, B, C (µL)100 Comparer les échantillons et conclure.

12 3. Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons Méthode au 4 Méthyl catéchol (4 MC). -- Il serait intéressant de comparer ces résultats avec ceux dune méthode voisine. Nous nous contenterons de lextrait E-A. Nous allons utiliser le catéchol comme substrat. Contrairement à son dérivé, le 4-MC, il possède un pic dabsorbance à 265 nm Détermination des paramètres enzymatiques Méthode « catéchol 265 ». -- Il ne suffit plus que dappliquer le protocole décrit par le tableau. IIIIIIIV ac ascorbique (5 mmol.L -1 )100 EDTA (0,065 mmol.L -1 )100 Catéchol (5 mmol.L -1 ) Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de lextrait) pré-incubation 5 mn à 25°C (si possible) Evaluer la vitesse spontanée de la réaction extrait E-A (µL)50 Ne pas faire le zéro - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 265 nm pendant 5 mn utiliser des cuves « spécial UV » - On définit une unité de tyrosinase comme la quantité qui provoque une diminution dabsorbance de 0,001 uA par minute dans ces conditions opératoires. Il faut faire un essai préliminaire (avec quel tube ?) pour vérifier que le volume de la prise dextrait est bien adapté et déterminer si une dilution est nécessaire.

13 3. Dosage de lactivité tyrosinase des 3 échantillons. -- La méthode à la DOPA utilise le substrat naturel de la tyrosinase. Lavantage est que lon connaît de du dopachrome ( = mol -1.L.cm -1 ) 3.3. Méthode « DL DOPA 475 ». -- Le protocole est particulièrement simple à suivre. IIIIIIIV DL DOPA (20 mmol.L -1 ) Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de lextrait) pré-incubation 5 mn à 25°C (si possible) Evaluer la vitesse spontanée de la réaction extrait E-A (µL)? - Mélanger par retournement. - Suivre absorbance à 475 nm pendant 3 mn La variation dabsorbance doit être comprise entre 0,03 et 0,3 uA.mn -1. La période de linéarité est alors inférieure ou égale à 3 mn. Au-delà, un brunissement du milieu réactionnel est normal. La encore il faut faire un essai préliminaire pour déterminer le volume de prise dessai et la dilution éventuelle Méthode « catéchol 265 ».

14 4. Chantage. Cest la dernière journée autour de Vesta. Dans h + 20 le module Héra entamera son retour vers Junon. Ripley se lave dans la salle des moteurs à un filet deau provenant de la condensation dans le circuit de refroidissement. -- Je me demandais ce que tu manigançais ici. -- Ca te ferai mal dannoncer quand tu arrives ? -- Cest mon vaisseau. Je suis le commandant, et je fais ce que je veux dans mon vaisseau. -- Ca ne tempêche pas de respecter lintimité des autres. -- Tu nas pas plus droit à lintimité quun vulgaire animal. Jai lu ton rapport. Je sais que tu es condamnée par contumace. Je sais le sort quon te réserve lorsque nous reviendrons sur Terre. -- Ces renseignements ne te concernent pas. Ils sont confidentiels. Comment te les es-tu procurés. -- Peu importe. Ce qui est important cest ce que je peux faire pour toi. Si tu montres que tu tes amendée, je suis sûr que les juges seront cléments. Il faut juste que tu te montres gentil Tu es une ordure. -- Pense à toi, et à Eva. Sais-tu ce quils sont capables de faire aux gens comme vous. Tu te souviens de la journaliste venue faire un reportage sur le Junon juste avant notre départ. Son article a été condamnée car il cautionné votre mode de vie. La journaliste a été internée. Les images des caméras de surveillance ont été diffusées sur le net. Ca a été un des meilleurs scores daudience. Il y a eu jusquà deux milliards de connections payantes à lheure où ses codétenus regagnaient la cellule. Elle sest suicidée au bout de dix jours. Je te laisse réfléchir. Dans le fond, peut-être quelle aimerait ça. Ripley tombe à genoux. Elle tient son visage entre ses mains et sert les dents pour ne pas hurler.

15 Ripley glisse ses 1m 85 dans le minuscule laboratoire de recherche du module. Ron est plongé dans la contemplation de ses colonnes de purification. -- Ron ? -- Ripley ! Quest-ce quil tarrive ? Tu as pleuré ? -- Cest rien. Un peu de vague à lâme. -- Cest Eva qui te manque. Dans quelques jours tu la retrouveras. -- Mais je serai à nouveau isolée. Je ne te verrai plus comme maintenant. -- Cest pas grave, je ne suis quun ours solitaire. 5. Influences environnementales. -- Tu es un mec bien, Ron. Quest-ce que tu penses de moi et dEva ? -- Du fait que vous soyez ensemble ? Je nai rien à y penser, cest votre vie privée. Limportant cest que tu as trouvé quelquun que tu aimes et qui te le rend. Cest si rare dans notre monde détraqué quil faut le protéger à tout prix. -- Tu as raison ! Je ferai ce quil faudra pour la protéger. -- Pour en revenir à nos moutons électriques, comme dirait Philip K. Dick, la différence dactivité tyrosinase des échantillons peuvent avoir deux origines : ou bien nous sommes en présence de trois phénomènes catalytiques distincts, provoqués par trois catalyseurs totalement différents. Ou bien il sagit du même catalyseur dont lactivité est modifiée par lenvironnement physico-chimique. Je penche pour cette seconde hypothèse. -- Pourquoi ? -- Tu connais la règle du rasoir dOccam ! Lhypothèse la plus simple a la plus grande probabilité dêtre exacte. Il nexiste pas une infinité de catalyseurs non protéiques. La probabilité den trouver trois différents sur un même astéroïde est minuscule. Par contre, les trois sites sont très différents et peuvent posséder des compositions chimiques différentes. -- Jai fini létude des prélèvements. Après élimination des éléments cristallins communs, jai découverts deux molécules spécifiques. Le site B contient du méta bisulfite. Le site C, quant à lui, contient de lacide cinaminique. Cest également un effecteur de tyrosinase. -- Nous allons testons laction de ces molécules sur lactivité catalytique de léchantillon A. Si ceux-ci présentent un effet inhibiteur, on pourra sérieusement suspecter la présence dune enzyme, et donc, de vie sur Vesta. Quest-ce que cest que cette histoire de moutons électriques?

16 5. Influences environnementales. Cest un agent réducteur puissant capable dinhiber un certain nombre denzyme. Cest un candidat de poids pour ton étude Site B : effet du méta-bisulfite. En quoi un réducteur peut-il interférer sur le pouvoir catalytique de la tyrosinase. Vol en mL0IIIIIIIV Tampon acétate (µL)550 4MC (à 5 mmol.L -1 ) (µL) prélèvement B Méta-bisulfite de Na : (0,25 mmol.L -1 ) (en µL) pré-incubation à 37°C directement dans une micro-cuve. H2OH2O qsp 2 mL (après addition de lextrait) Extrait E-A (µL)100 noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s) Quand on analyse globalement la manip, on se rend compte quil nest pas obligé de préparer tous les tubes décrits dans le tableau.

17 5. Influences environnementales. -- Ron, quest-ce que tu ferais si pour protéger la personne que tu aimes tu devais la perdre ? -- Je me demanderai si la personne que jaime supporterait lidée de me perdre. -- Sans doute pas plus que toi tu supporterais de la perdre. -- Alors cest une décision à prendre à deux ! Je suis sûr quEva refuserait que tu assumes toute la responsabilité dune décision qui vous concerne toute les deux Site B : effet du méta-bisulfite.

18 5. Influences environnementales. -- Oublie ce que je viens de te dire et continuons notre exploration. Nous devons tester le prélèvement C qui contient de lacide cinaminique. -- Jai la formule chimique. -- Quand on voit la molécule, on devine par quel mécanisme il peut bloquer le fonctionnement de lactivité tyrosinase Site B : effet du méta-bisulfite.5.2. Site C : effet du cinaminate. Développer cette argumentation. -- Le principe de la manipulation est le même que pour le prélèvement B. On garde le bocal et on change les cornichons ! Vol en mLIIIIIIIV Tampon acétate (µL)550 4MC (à 5 mmol.L -1 ) (µL) prélèvement C ac cinaminique (3 mmol.L -1 ) (en µL) H2OH2O qsp 2 mL (après addition de lextrait) Extrait E-A (µL)100 noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s)

19 5. Influences environnementales Site C : effet du cinaminate. -- Si cest John qui te pose des problèmes, tu nas quun mot à dire et je lui explique que lon nimportune pas les dames. Je me sens des talents de pédagogue. -- Il vaut mieux que tu ne ten mêles pas. Je suis assez grande pour me débrouiller toute seule.

20 5. Influences environnementales Etudes complémentaires. -- Si on a le temps, je voudrais tenter un dosage. Mesurer leffet du cinaminate par la méthode « DOPA 475 ». Vol en mLIIIIIIIV DL DOPA (20 mmol.L -1 ) Tp pH 6,5 qsp 3 mL (après addition de lextrait) prélèvement C (ac cinaminique) (en µL) Extrait E-A (µL)voir noter l'absorbance à t = 15 s. et à t = fin de linéarité (135 s)

21 -- Il ne me reste plus qua taper le rapport. Angie doit être impatiente de regarder nos résultats. -- Quest-ce quelle attend exactement ? -- Tous les calculs de vitesses justifiés par nos choix de manip. Lanalyse comparée de ces résultats et les conclusions. La routine, quoi. -- Je vais rester avec toi pour taider. -- Dis-moi un truc, Ron ! Tu ne serais pas en train de tomber amoureux de moi ? -- Moi ? Surement pas, cest trop dangereux de fréquenter des « louves » !


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