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D é tection optique de biomol é cules uniques Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure.

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1 D é tection optique de biomol é cules uniques Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

2 Présentation générale Microscopie de fluorescence description simple dun système fluorescent sondes fluorescentes : colorants, GFP, nanocristaux Détecter une molécule unique Rapport signal sur bruit, bruit de photon,… Approches expérimentales Applications en biophysique Résolution vs localisation : mouvement de la myosin V, microscopie ultrarésolution « Motility assays »: myosine/actine, kinesine/microtubule, protéine/ADN Mesure en polarisation: dynamique rotationelle de F1-ATPase Relation Conformation/Dynamique : approche par transfert dénergie de Forster et par transfert électronique – étude du répliement des protéines Suivi de molécules uniques en cellules vivantes : diffusion membranaire, expression genique

3 Motivations : « aller au-delà des valeurs moyennes » fluctuations statistiques : En analysant molécule par molécule, on peut identifier et analyser les inhomogénéités dans léchantillon

4 Motivations (2) : pour analyser des processus stochastiques fluctuations dynamiques : En mesurant létat dune molécule au cours du temps, on peut déterminer les constantes cinétiques qui gouvernent son évolution, même si on est à léquilibre

5 Mesure densemble :

6 (cf. JFA – cours n°2)

7 Historique

8 Canaux ioniques Neher et Sackmann (1976) [Prix Nobel 1991]

9 Mesures optiques détection optique dune molécule unique – mesure à basse température (1989) – mesure à température ambiante ( ) premières expériences sur des biomolécules in vitro : – activité enzymatique dune cholestérol oxydase (1998) – conformation de petites molécules dADN et ARN (1999) – activité dune exonucléase (1999) premières expériences in vivo: – suivi de lentrée dun adéno-virus (2001) – diffusion latérale de canaux calciques (2001) – organisation membranaire de récepteurs dans des amibes Dictyostelium discoideum (2001)

10 Microscopie de fluorescence

11 Fluorescence Lorsquils sont dans un niveau excité, certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se désexciter en émettant des photons. excitation La longueur donde démission est (souvent) plus grande que plus celle dabsorption et il est possible de sélectionner spectralement la lumière émise microscopie de fluorescence

12 Microscopie de fluorescence Il sagit donc dune détection sur fond noir

13 Voir des biomolécules en fluorescence En général, les molécules biologiques (protéines, acides nucléiques,…) ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines, NADH, GFP,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de fluorescence dans lUV (tryptophane). On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents : couplage covalent (liaison chimique) marquage daffinité: on utilise une molécule fluorescente qui vient sattacher spécifiquement (anticorps, toxines,…) clonage dune protéine fluorescente

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15 Modèle dun système fluorescent à deux niveaux

16 Description dun système fluorescent à 2 niveaux |e> |g> T fluo est la durée de vie radiative est la section efficace dabsorption est le coefficient dextinction La molécule peut se désexciter de deux manières différentes : en émettant un photon ou non radiativement.

17 Taux de fluorescence Taux de fluorescence Solution à létat stationnaire:

18 Pour gagner en signal sur bruit, on essaie toujours davoir I << I s Cas limites A faible intensité, régime linéaire : A forte intensité, régime saturée : Efficacité quantique radiative probabilité quun photon absorbé soit réémis

19

20 Etude résolue en temps Si on excite avec un laser pulsé (à la fréquence 1/T rep ): Si on connaît : On peut déterminer k r et k nr

21 Marqueurs fluorescents: molécules, protéines, nanocristaux

22 Fluorophores organiques

23 Diagramme de Jablonski

24 système à trois niveaux On prend en compte létat triplet

25 Green fluorescent protein Découverte en 1961 dans la méduse Aequorea Victoria, clonée en 1992

26

27 Absorption Fluorescence

28 R. Tsien, FEBS Lett Aussi, des mutants: photoactivables, dont lémission change dans le temps sensibles au calcium indicateurs de la phosphorylation … Autres mutants/ Autres couleurs :

29 Nanocristaux semiconducteurs Nanoparticules composées de 100 à atomes of CdSe recouverts par une coquille de ZnS 2-5 nm

30 Des boites quantiques de quelques nanomètres Une particule dans une boite à 1 D : Quels sont les niveaux dénergie des électrons ? V(x) 0L (en fait la boite est tridimensionnelle…) Fonctions propres: Energies propres:

31 Emission et absorption ajustable avec la taille des nanoparticules 2.2 nm CdSe 5.0 nm CdSe absorption Plus les particules sont petites, plus lemission est décalée vers les courtes longueurs donde (grandes énergies) LL

32 Semiconductor Quantum Dots

33 Longueur donde taille Excitation Colorant Nanocristal Spécificités spectrales et photophysique des nanocristaux par rapport à des émetteurs organiques emission etroite (quasi-atomique) absorption large (solide) photostabilité

34 Détection de molécules fluorescentes uniques

35 Problème de détection: quel est le rapport signal sur bruit ? Signal S de fluorescence (dune seule molécule) Bruit B de variance de moyenne m B et de variance B :

36 Sources de bruit Fluctuations intrinsèques (bruit de photon / shot noise) Signal optique parasite (autofluorescence, lumière diffusée,…) proportionnel à lintensité lumineuse I Bruit électronique (courant dobscurité, bruit de lecture,…) indépendant de lintensité lumineuse

37 Bruit de Photon et Processus de Poisson On considère un flux où des particules (des photons) arrivent avec un taux k sur un détecteur (une photodiode). On fait lhypothèse que ce qui se passe entre t et (t+dt) est indépendant de ce qui se passe entre 0 et t (processus de Markov).

38 Quel est la distribution du temps dattente du premier evènement ? Quelle est la probabilité P quon ne détecte rien entre 0 et t ? Quelle est la probabilité de détecter n photons durant le temps t ? (distribution de Poisson)

39 Distribution de Poisson Valeur moyenne : Variance :

40 Bruit dorigine lumineuse Bruit de photons des molécules (non saturées): Bruit dû à la lumière parasite :

41 Sources de bruit électronique Bruit noir de lecture : dû au convertisseur analogue-digital Courant dobscurité : du à lapparition de N obs photoélectrons à cause du bruit thermique (proportionnel au temps) Nombre de coups lecture Lumière incidente Crée des photolélectrons

42 Rapport signal sur bruit Cas limite du « shot noise »:

43 Identifier un fluorophore unique Pour un fluorophore : photodestruction instantanée (molécule de Cy3) Possibilité de réduire le photobleaching avec des « oxygen scavengers »

44 Scintillement dun nanocristal unique

45 Tableau comparatif TaillePhotostabilitéAbsorptionStoechiometry Cy31 nm~ 5 s = GFP2-4 nm~ ms = QD nm > 20 mn = /++ Bille latex 100 nm 1 µm Diffusion Contraste de phase -

46 Approches expérimentales

47 Champ proche Betzig (1992,1994)

48 Microscopie de champ lointain : microscopie confocale

49 Mesure en diffusion Chaque molécule qui traverse par diffusion le volume de focalisation émet des photons Nie and Zare, Science (1994) Détection de molécules uniques si : Temps de diffusion: V eff = 1x1x1 µm 3 = 1 fl C < 1 nM t ~ L²/4D ~ ms (FCS: C = 5-10 nM) Analyse des corrélations temporelles: FCS

50 Microscopie en balayage Laser Photodiode, PM Trou de filtrage Objectif On déplace le point de focalisation sur léchantillon.

51 Inconvénient : le temps passé sur la molécule est bref Taille de limage : N p *N p pixels - Taille de la molécule : N m *N m pixels Fraction du temps passée à exciter la molécule : F = (N m /N p )² Exemple : taille dun pixel : 200 nm, N p = 100, N m = 4, soit F = 0,16 % Si durée totale de limage : 100 ms (10 µs/pixel), cela correspond à 160 µs. NmNm NpNp

52 Microscopie en épifluorescence On éclaire léchantillon avec une lumière collimatée. Pour cela, on focalise la lumière dans le plan focal arrière de lobjectif. Lampe UV ou Laser CCD Camera

53 Problème Dans un échantillon épais, on collecte la lumière de tous les plans de léchantillon profondeur champ Excitation Objet dans le plan focal Objet au dessus du plan focal Objet en dessous du plan focal Détection Comment se débarasser de la lumière provenant des plans hors focus ?

54 Microscopie en onde évanescente Angle critique :

55 Il faut que lobjectif ait une ouverture numérique supérieure à n 2

56 Vérification expérimentale Sarkar, Atom et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101,

57 Détection de molécules uniques dans structures nanofabriquées Veff = 20x50x50 nm 3 = litres Détection de molécules uniques si : C < 30 µM Science 299, 682 (2002) Permet de suivre lactivité enzymatique (ex. séquencage de lADN en molécules uniques)


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