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La réalisation des TP d'enzymologie s'organisent en trois étapes. * Les précautions préalables. - la dilution éventuelle de l'enzyme. - la vérification.

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2 La réalisation des TP d'enzymologie s'organisent en trois étapes. * Les précautions préalables. - la dilution éventuelle de l'enzyme. - la vérification du domaine de vitesse stationnaire si on utilise la méthode à deux points. * L'étalonnage. * La détermination des Vm et Km.

3 * Les précautions préalables. La première étape est de vérifier si la concentration de l'enzyme (l'activité de la solution fournie) est compatible avec les conditions du dosage. Si l'enzyme est trop concentrée, l'absorbance des préparations dépasseront rapidement les capacité des appareils > il faut alors la diluer puis vérifier que la dilution choisie est la bonne. Si l'enzyme n'est pas assez concentrée, les vitesses de réaction seront très faibles et les variations d'absorbances difficilement exploitables > On ne peut rien faire pour la solution enzymatique. On tente de compenser cette faiblesse en utilisant des concentrations importantes de substrat. Sans garantie que ça marche. Il faut essayer. Le spectro clignote à 2 au bout de 10 secondes ! Retour au menu

4 En pratique: * Les précautions préalables. On prépare le mélange réactionnel comme indiqué dans le protocole: - substrat - tampon - enzyme On passe au spectro et on guette l'absorbance. - en continue si c'est possible ( -gal) - au bout du temps d'incubation indiqué (invertase) On interprète les observations: on anticipe la réaction de l'enzyme en fonction des concentrations de substrat au cours de la manipulation. Retour au menu

5 Dans le cas d'un dosage à deux points, il faut vérifier que le temps d'incubation donné appartient au domaine de vitesse stationnaire. Ce domaine est l'intervalle de temps où la vitesse est constante (maximale à cette concentration de substrat), c'est à dire, que l'absorbance croit de façon linéaire. On le met en évidence en effectuant une cinétique continue. vitesse stationnaireralentissement On choisit le temps d'incubation dans cet intervalle. Retour au menu

6 Dans le cas dun dosage à deux points, on sait que la variation d'absorbance, à l'intérieur de ce domaine, suit une droite qui passe par l'origine et par le point expérimental. La pente de cette droite se calcule simplement grâce à léquation: vitesse stationnaireralentissement On choisit le temps d'incubation dans cet intervalle. Abs t a = Abs x – Abs 0 = Abs = Vi t – t 0 t incubation Retour au menu

7 * L'étalonnage. Je naurais pas loutrecuidance dexpliquer à des BTK-2 le principe de létalonnage. En cas de doute soudain, je vous renvoie au TP 01. Je veux juste faire une remarque. En enzymo, on dose, le plus souvent, le produit de la réaction. Par conséquent, létalonnage se fait avec le produit, tandis que la gamme utilisé pour les cinétiques se fait avec le substrat. Ca parait évident comme ça, mais devant le charriot de matériel… EtalonnageONP cinétiquesONPG Retour au menu

8 Il est possible de calculer après létalonnage. Ce calcul ne présente aucun intérêt pratique car tous les calculs sont effectuer avec léquation de la droite. Mais si cette valeur est demandée, on est obligé de la calculer. Retour au menu * L'étalonnage. Revenons aux fondamentaux, cest-à-dire léquation de Berr-Lambert. A =.C.l Soyons clair ! Il est hors de question dutiliser les valeurs dun point pris au hasard dans la droite étalon pour effectuer le calcul. Premièrement parce que ce nest pas fun. Deuxièmement parce que les points sont entachés dincertitude. Cest pour cela que lon utilise une gamme. On connait léquation de la droite * : A = a.C où a est le coefficient directeur de la droite. * Je considère le cas simple de la droite passant pas zéro.

9 Retour au menu * L'étalonnage. A =.C.l A = a.C doù.= a / l puisque l = 1 (cm) donc = a Ce nest vrai quà une condition: les concentrations considérées utilisent la même unité, en loccurrence les mol.L -1 ! Sinon: * on calcule les concentrations de la gamme en mol.L -1 et on retrace la droite étalon. Abs C en mol.L -1 a = en L.mol -1.cm -1

10 Retour au menu * L'étalonnage. doù.= a / l avec l = 1 (cm) donc = a Ce nest vrai quà une condition: les concentrations considérées utilisent la même unité, en loccurrence les mol.L -1 ! Sinon: * on extrapole la valeur de a en mol.L > Ce nest pas une conversion comme pour la gamme. Lavantage, cest que lon manipule des valeur « présentables » sans décimales. A = a.C A =.C.l Marche à suivre. Labsorbance théorique dune solution à 1 mol.L -1 est égale à 10 6 absorbance de la même solution qui serait à 1 µmol.L > En pratique, cest évidemment faux à cause du domaine de linéarité de la méthode.

11 Retour au menu * L'étalonnage. Sinon: A lue = a.C A mol.L-1 =.C.l en mol.L -1 en µmol.L -1 A théo = a x C en mol.L -1 Marche à suivre. Labsorbance théorique dune solution à 1 mol.L -1 est égale à 10 6 absorbance de la même solution qui serait à 1 µmol.L -1. doù = a > En pratique, cest évidemment faux à cause du domaine de linéarité de la méthode. * on extrapole la valeur de a en mol.L > Ce nest pas une conversion comme pour la gamme. Lavantage, cest que lon manipule des valeur « présentables » sans décimales.

12 * La détermination des Vm et Km. En tout premier lieu, tracer la courbe de Michaëlis pour vérifier que lenzyme possède bien un comportement michaëlienne. Vi [ S ] -----> Cest une vérification personnelle. Il nest pas forcément besoin de joindre la courbe au compte-rendu. Par contre, il faut signaler quelle a été faite. Retour au menu

13 Après traçage du double inverse, déterminer sil est nécessaire décarter des points. Les moins fiables sont les points de droite (1/C grand) car ils possèdent les % de certitude les plus faibles. 1/Vi [ 1/S ] * La détermination des Vm et Km > Attention, comme toute règle, elle nest pas systématique. 1/Vi = a. (1/S) + b Vm = 1 / b Km = a / b Retour au menu


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