Méthodes de transformation des plastes

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1 Méthodes de transformation des plastes
Bréard Dimitri; Delecolle Julien; Di Pascoli Thomas M1 BVP - VRV

2 Plan I) Introduction Différents types de génomes III) Applications
Théorie endosymbiotique La « tomate dorée ». Les plastes Autres exemples remarquables Problèmes rencontrés IV) Discussion II) Transformations Différentes types de transformations V) Références La biolistique Publications La méthode des PEGs Images 2) Mécanismes d’intégrations et d’expressions du transgène Recombinaison homologue Expression des gènes polycistroniques Gènes marqueurs de sélection Expression transitoire Comparaison avec la transformation nucléaire

3 1) Distribution génomique
I) Introduction

4 2) La théorie endosymbiotique

5 3) Les plastes Amyloplastes Oléinoplates Protéinoplastes

6 4) Problèmes rencontrés
1) Comment faire passer le transgène dans le chloroplaste? 2) Aucuns virus ou bactéries de connus pour infecter les chloroplastes et servir de vecteur de transfert.

7 II) Transformations de plastes
Nicotiana tobacum Plante modèle pour la transformation des plastes. Chloroplastes = plastes les mieux étudiés et les plus ciblés pour la transformation.

8 1) Les différentes transformations
La biolistique : Particules d’or ou de tungstène de 0,4 à 1μM de diamètre.  2 régénérations sur milieu sélectif pour n’avoir que des plastes transformés L’intégration se fait également dans les plastes

9  Bombarder les tissus (cellules) méristématiques.
Toutes les plantes ne peuvent pas être transformées directement par des sections de leurs feuilles:  Bombarder les tissus (cellules) méristématiques. Les cellules peuvent contenir entre 10 et 14 proplastes (100aine de chloroplastes pour une cellule de feuille) Après divisions, le nombre de plastes transformés augmentera plus rapidement.  Les plastes non-transformés vont se « perdre » par dilution. Coton Soja

10 Polyéthylène Glycol (PEG)
b) Méthode des PEGs : Protoplastes Polyéthylène Glycol (PEG) Déstabilisation des membranes plasmiques permettant l’insertion de transgènes.

11 PEG plus cher que la biolistique et mécanismes très peu connus.
Et Agrobactérium dans tout ça ???  Peu efficace pour la transformation de plastes.

12 2) Mécanismes d’intégration et d’expression du transgène
a) Recombinaison homologue GOI = gene of interest Insertion ciblée à l’aide de séquences homologues. Site d’intégration choisi: moins d’impact sur le développement et la viabilité. « Copy correction » : Intégration dans séquence répétée inversée (IR), duplication dans l’autre IR. Augmentation du nombre de protéines recombinantes. 2) Mécanismes d’intégration et d’expression du transgène D’après Meyers 2010.

13 b) Expression des gènes polycistroniques
Expression de plusieurs gènes (comme opéron). Un promoteur et un terminateur pour tous les ORFs. Chaque ORF nécessite un site de liaison aux ribosomes (RBS) pour pouvoir être traduits. Simplification de la transformation (plusieurs gènes d’intérêts). Réduction du nombre d’étapes de transformation. Insertion des RBS entre les ORFs. D’après Meyers 2010.

14 c) Gènes marqueurs de sélection
Le plus utilisé: gène aadA , résistance à la spectinomycine. Gènes de résistance kanamycine, Chloramphénicol également utilisés. Le gène de résistance peut être couplé au système Cre/Lox. Séquences flanquantes au transgène spécifiquement reconnues par une recombinase codée par le système Cre/Lox. Le gène de résistance sera supprimé de la construction. Utile pour la transformation de plantes de grandes cultures. D’après Bock 2011.

15 ? d) Expression transitoire
« Prototypage » du transgène dans Escherichia coli. Similarité des mécanismes de transcription et traduction de E.coli et du plaste. Etudes du transgène dans la bactérie. Un transgène qui s’exprime bien dans la bactérie devrait bien s’exprimer dans les plastes. ?

16 3) Comparaison avec la transformation nucléaire.
Noyau Plaste Méthodes de transformation Agrobactérium = méthode universelle. Biolistique et PEG/protoplastes pour les plantes sans hôtes naturels Biolistique (la plus utilisée). PEG/protoplastes Rendement de transformation Avec Agrobactérium, un disque foliaire donne 10aine de plantes. Avec biolistique 1 à 2 disques foliaires pour 1 transformant. Vecteurs de transformation Le même vecteur binaire utilisé pour plusieurs espèces. Séquences homologues ajustées d’une espèce à l’autre. Expression transitoire Agroinfiltration. Biolistique. Vecteur viral. Insertion dans E. coli = évaluation de la construction. D’après Meyers 2010.

17 Niveau d’expression des protéines recombinantes
Noyau Plaste Niveau d’expression des protéines recombinantes N’excède pas 1-2% des protéines solubles totales (TSP). 5 à 25% de TSP. Intégration de plusieurs transgènes 2 à 3 transgènes avec vecteurs binaires classiques Expression de plusieurs transgènes (polycistronique). Effets de position Intégration aléatoire  effets de position et RNA silencing. Intégration ciblée  recombinaison homologue  minimise les effets de position. Confinement du transgène Nécessites d’autres transformations pour rendre la plante stérile. Hérédité maternelle des plastes  pas de transmission par le pollen. Applications biotechnologiques Insertion de gènes de résistances (herbicide, insectes). Insertion d’une voie métabolique (multiples transgènes); forte expression de protéines recombinantes. D’après Meyers 2010.

18 III) Applications 1) La « tomate dorée »

19 x2 β-carotène Vitamine A Solanum lycopersicum L.
ββ-carotène 15,15’ monooxygénase x2 Solanum lycopersicum L. D’après Apel 2009.

20 Expériences préalables
Expression constitutive de la phytoène désaturase de la bactérie Erwinia uredovora dans la tomate. Accumulation élevée de β-carotène Baisse des caroténoïdes totaux b) Surexpression spécifique de la lycopène-β-cyclase endogène dans le fruit de tomate. Accumulation élevée de β-carotène Taux de caroténoïdes constants Comment augmenter ce taux?

21  La transplastomique  Augmenter la conversion du lycopène en β-carotène tout en augmentant les taux de caroténoïdes du fruit. Le gène de la lycopène-β-cyclase de Narcissus pseudonarcissus est introduit dans les plastes de tomate: - Isolement du transgène (gène de la lycopène-β-cyclase) Clonage dans un plasmide Transformation par biolistique Sélection de lignées homoplastomiques

22 La construction Promoteur d’opéron d’ARNr fusionné au gène 10 phage T7
Marqueur de sélection D’après Apel 2009.

23 Test d’activité de l’enzyme par un herbicide (CPTA)
 CPTA = inhibiteur spécifique de la lycopène cyclase Résistance  Activité de la lycopène-β-cyclase très fortement augmentée chez les plantes tranplastomiques D’après Apel 2009.

24  Transformation du lycopène (rouge) en β-carotène (orange)
Analyse du phénotype  Transformation du lycopène (rouge) en β-carotène (orange) D’après Apel 2009.

25 Teneur en caroténoïdes dans les plastes par HPLC
 Augmentation du β-carotène, diminution du lycopène ET augmentation de 52% des caroténoïdes totaux D’après Apel 2009.

26 Composition en caroténoïdes dans les feuilles par HPLC
Orientation vers les caroténoïdes de type xanthophylle à la place de la lutéine.  Pas d’augmentation des caroténoïdes totaux D’après Apel 2009.

27 Conclusion  Augmentation de la teneur en β-carotène dans le fruit
Augmentation des caroténoïdes totaux de 52% Approximativement 1mg de β-carotène /g de poids sec (AJR de 10mg/jour) La 2eme transformation de plastes dans une plante de culture (après le tabac) AJR = apport journalier recommandé

28 2) Autres exemples remarquables
Expression de somatotropine (>7% des TSP) dans les plastes de tabac avec formation correcte des ponts disulfures. Expression de toxine Bt de 3 à 5% des TSP (issue de Bacillus thuringiensis) dans les plastes de tabac. TSP = Total Soluble Protein

29 IV) Discussion Perspectives:
Insertion d’une RUBISCO plus efficace dans les plantes de cultures. Production de molécules pharmaceutiques avec de forts rendements. Production de bioéthanol par augmentation du contenu lipidique synthétisé par les plastes.

30 V) Références Publications
Transgenic Plastids in Basis Research and Plant Biotechnology - Review Article; Journal of Molecular Biology, Volume 312, Issue 3, 21 September 2001, Pages Ralph Bock Taming plastids for a green future – Review Article; Trends in Biotechnology, Volume 22, Issue 6, June 2004, Pages Ralph Bock; Muhammad Sarwar Khan Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana; Nature Biotechnology, Volume 25, Issue 5, May 2007, Pages Rashad Kebeish, Markus Niessen, Krishnaveni Thiruveedhi, Rafijul Bari, Heinz-Josef Hirsch, Ruben Rosenkranz, Norma Stäbler, Barbara Schönfeld, Fritz Kreuzaler & Christoph Peterhänsel Enhancement of carotenoids biosynthesis in transplastomic tomatoes by induced lycopene-to-provitamin A conversion; Plant physiology, Volume 51, Septembre 2009, Pages Wiebke Apel, Ralph Bock Plastid biotechnology: food, fuel and medicine for the 21st century; Plant Physiology Preview, January 2011, Pages 1-27. Pal Maliga, Ralph Bock

31 2) Images