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Méthodes de transformation des plastes Bréard Dimitri; Delecolle Julien; Di Pascoli Thomas M1 BVP - VRV.

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1 Méthodes de transformation des plastes Bréard Dimitri; Delecolle Julien; Di Pascoli Thomas M1 BVP - VRV

2 Plan I) Introduction 1)Différents types de génomes 2)Théorie endosymbiotique 3)Les plastes 4)Problèmes rencontrés II) Transformations 1)Différentes types de transformations La biolistique La méthode des PEGs 2) Mécanismes dintégrations et dexpressions du transgène Recombinaison homologue Expression des gènes polycistroniques Gènes marqueurs de sélection Expression transitoire 3)Comparaison avec la transformation nucléaire III) Applications 1)La « tomate dorée ». 2)Autres exemples remarquables IV) Discussion V) Références 1)Publications 2)Images

3 1) Distribution génomique I) Introduction

4 2) La théorie endosymbiotique

5 3) Les plastes Amyloplastes Oléinoplates Protéinoplastes

6 4) Problèmes rencontrés 1) Comment faire passer le transgène dans le chloroplaste? 2) Aucuns virus ou bactéries de connus pour infecter les chloroplastes et servir de vecteur de transfert.

7 II) Transformations de plastes Plante modèle pour la transformation des plastes. Chloroplastes = plastes les mieux étudiés et les plus ciblés pour la transformation. Nicotiana tobacum

8 1) Les différentes transformations a)La biolistique : Particules dor ou de tungstène de 0,4 à 1μM de diamètre. Lintégration se fait également dans les plastes 2 régénérations sur milieu sélectif pour navoir que des plastes transformés

9 Toutes les plantes ne peuvent pas être transformées directement par des sections de leurs feuilles: Bombarder les tissus (cellules) méristématiques. Les cellules peuvent contenir entre 10 et 14 proplastes (100 aine de chloroplastes pour une cellule de feuille) Après divisions, le nombre de plastes transformés augmentera plus rapidement. Les plastes non-transformés vont se « perdre » par dilution. SojaCoton

10 b) Méthode des PEGs : Polyéthylène Glycol (PEG) Déstabilisation des membranes plasmiques permettant linsertion de transgènes. Protoplastes

11 PEG plus cher que la biolistique et mécanismes très peu connus. Et Agrobactérium dans tout ça ??? Peu efficace pour la transformation de plastes.

12 Insertion ciblée à laide de séquences homologues. Site dintégration choisi: moins dimpact sur le développement et la viabilité. « Copy correction » : Intégration dans séquence répétée inversée (IR), duplication dans lautre IR. Augmentation du nombre de protéines recombinantes. a) Recombinaison homologue Daprès Meyers GOI = gene of interest 2) Mécanismes dintégration et dexpression du transgène

13 Expression de plusieurs gènes (comme opéron). Un promoteur et un terminateur pour tous les ORFs. b) Expression des gènes polycistroniques Simplification de la transformation (plusieurs gènes dintérêts). Réduction du nombre détapes de transformation. Chaque ORF nécessite un site de liaison aux ribosomes (RBS) pour pouvoir être traduits. Insertion des RBS entre les ORFs. Daprès Meyers 2010.

14 Le plus utilisé: gène aadA, résistance à la spectinomycine. Gènes de résistance kanamycine, Chloramphénicol également utilisés. Le gène de résistance peut être couplé au système Cre/Lox. Séquences flanquantes au transgène spécifiquement reconnues par une recombinase codée par le système Cre/Lox. Le gène de résistance sera supprimé de la construction. Utile pour la transformation de plantes de grandes cultures. c) Gènes marqueurs de sélection Daprès Bock 2011.

15 d) Expression transitoire « Prototypage » du transgène dans Escherichia coli. Similarité des mécanismes de transcription et traduction de E.coli et du plaste. Etudes du transgène dans la bactérie. Un transgène qui sexprime bien dans la bactérie devrait bien sexprimer dans les plastes.

16 3) Comparaison avec la transformation nucléaire. NoyauPlaste Méthodes de transformation 1)Agrobactérium = méthode universelle. 2)Biolistique et PEG/protoplastes pour les plantes sans hôtes naturels 1)Biolistique (la plus utilisée). 2)PEG/protoplastes Rendement de transformation Avec Agrobactérium, un disque foliaire donne 10 aine de plantes. Avec biolistique 1 à 2 disques foliaires pour 1 transformant. Vecteurs de transformation Le même vecteur binaire utilisé pour plusieurs espèces. Séquences homologues ajustées dune espèce à lautre. Expression transitoire Agroinfiltration. Biolistique. Vecteur viral. Insertion dans E. coli = évaluation de la construction. Daprès Meyers 2010.

17 NoyauPlaste Niveau dexpression des protéines recombinantes Nexcède pas 1-2% des protéines solubles totales (TSP). 5 à 25% de TSP. Intégration de plusieurs transgènes 2 à 3 transgènes avec vecteurs binaires classiques Expression de plusieurs transgènes (polycistronique). Effets de position Intégration aléatoire effets de position et RNA silencing. Intégration ciblée recombinaison homologue minimise les effets de position. Confinement du transgène Nécessites dautres transformations pour rendre la plante stérile. Hérédité maternelle des plastes pas de transmission par le pollen. Applications biotechnologiques Insertion de gènes de résistances (herbicide, insectes). Insertion dune voie métabolique (multiples transgènes); forte expression de protéines recombinantes. Daprès Meyers 2010.

18 III) Applications 1) La « tomate dorée »

19 Vitamine A β-carotène Solanum lycopersicum L. Daprès Apel x2 ββ-carotène 15,15 monooxygénase

20 Expériences préalables a)Expression constitutive de la phytoène désaturase de la bactérie Erwinia uredovora dans la tomate. Accumulation élevée de β-carotène Baisse des caroténoïdes totaux b) Surexpression spécifique de la lycopène-β-cyclase endogène dans le fruit de tomate. Accumulation élevée de β-carotène Taux de caroténoïdes constants Comment augmenter ce taux?

21 La transplastomique Augmenter la conversion du lycopène en β-carotène tout en augmentant les taux de caroténoïdes du fruit. Le gène de la lycopène-β-cyclase de Narcissus pseudonarcissus est introduit dans les plastes de tomate: - Isolement du transgène (gène de la lycopène-β-cyclase) - Clonage dans un plasmide - Transformation par biolistique - Sélection de lignées homoplastomiques

22 La construction Daprès Apel Marqueur de sélection Promoteur dopéron dARNr fusionné au gène 10 phage T7

23 Test dactivité de lenzyme par un herbicide (CPTA) Résistance Activité de la lycopène-β-cyclase très fortement augmentée chez les plantes tranplastomiques Daprès Apel CPTA = inhibiteur spécifique de la lycopène cyclase

24 Analyse du phénotype Transformation du lycopène (rouge) en β-carotène (orange) Daprès Apel 2009.

25 Teneur en caroténoïdes dans les plastes par HPLC Augmentation du β-carotène, diminution du lycopène ET augmentation de 52% des caroténoïdes totaux Daprès Apel 2009.

26 Composition en caroténoïdes dans les feuilles par HPLC Orientation vers les caroténoïdes de type xanthophylle à la place de la lutéine. Pas daugmentation des caroténoïdes totaux Daprès Apel 2009.

27 Conclusion Augmentation de la teneur en β-carotène dans le fruit Augmentation des caroténoïdes totaux de 52% Approximativement 1mg de β-carotène /g de poids sec (AJR de 10mg/jour) La 2 eme transformation de plastes dans une plante de culture (après le tabac) AJR = apport journalier recommandé

28 2) Autres exemples remarquables Expression de somatotropine (>7% des TSP) dans les plastes de tabac avec formation correcte des ponts disulfures. Expression de toxine Bt de 3 à 5% des TSP (issue de Bacillus thuringiensis) dans les plastes de tabac. TSP = Total Soluble Protein

29 IV) Discussion Perspectives: -Insertion dune RUBISCO plus efficace dans les plantes de cultures. -Production de molécules pharmaceutiques avec de forts rendements. -Production de bioéthanol par augmentation du contenu lipidique synthétisé par les plastes.

30 V) Références 1)Publications Transgenic Plastids in Basis Research and Plant Biotechnology - Review Article; Journal of Molecular Biology, Volume 312, Issue 3, 21 September 2001, Pages Ralph Bock Taming plastids for a green future – Review Article; Trends in Biotechnology, Volume 22, Issue 6, June 2004, Pages Ralph Bock; Muhammad Sarwar Khan Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana; Nature Biotechnology, Volume 25, Issue 5, May 2007, Pages Rashad Kebeish, Markus Niessen, Krishnaveni Thiruveedhi, Rafijul Bari, Heinz-Josef Hirsch, Ruben Rosenkranz, Norma Stäbler, Barbara Schönfeld, Fritz Kreuzaler & Christoph Peterhänsel Enhancement of carotenoids biosynthesis in transplastomic tomatoes by induced lycopene- to-provitamin A conversion; Plant physiology, Volume 51, Septembre 2009, Pages Wiebke Apel, Ralph Bock Plastid biotechnology: food, fuel and medicine for the 21st century; Plant Physiology Preview, January 2011, Pages Pal Maliga, Ralph Bock

31 2) Images Potato_amyloplasts,_ESEM-SPL.jpg%3Fid%3D Potato_amyloplasts,_ESEM-SPL.jpg%3Fid%3D https://www.erowid.org/library/books_online/ayahuasca_apa/images/nicotiana_tabacum.jpg https://www.msu.edu/course/isb/202/ebertmay/drivers/mirkov_gentran.jpg Image.jpg Image.jpg


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