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Etude de l'adaptation des organismes marins en environnement variable Arnaud Tanguy, Didier Jollivet Station Biologique de Roscoff, UMR CNRS 7144, Adaptation.

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1 Etude de l'adaptation des organismes marins en environnement variable Arnaud Tanguy, Didier Jollivet Station Biologique de Roscoff, UMR CNRS 7144, Adaptation et Diversité en Milieu Marin, Equipe Ecologie et Génétique des Populations Marines

2 Mécanismes physiologiques et génétiques de la réponse aux stress chez lhuître creuse Crassostrea gigas Dario Moraga, Marie Thérèse Thébault, Philippe Soudant Christophe Lambert Laboratoire des Sciences de lEnvironnement Marin (LEMAR) Institut Universitaire Européen de la Mer (IUEM) UMR CNRS 6539, Université de Bretagne Occidentale Plouzané. Equipe 3 de lUMR 6539 Réponses des organismes et des populations à la variabilité environnementale Thème 2 Réponses aux stress et adaptation …

3 Molécule Gène Cellule Organisme Individu Population Groupes fonctionnels Communautés Peuplements Expression de gène Génotoxicité Protéines de stress Croissance Reproduction Polymorphisme Dynamique de population Abondance et diversité spécifiques, écologie Réponse au stress Différents niveaux dintégration et détude de la réponse des organismes face au stress Signification ECOLOGIQUE Signification TOXICOLOGIQUE Approche génétique intégrée de la réponse au stress

4 Sélection / Adaptation ? Paramètres biologiques (Fécondité, génotoxicité, etc.) Intégration des réponses: corrélation phénotypes / génotypes au niveau populationnel Analyse de lexpression des gènes Analyse du polymorphisme des gènes candidats Recherche de gènes candidats en réponse au stress environnementaux Approche génétique intégrée de la réponse au stress

5 Les sources de stress oxydatif Caractéristiques des fluides Température élevée ( °C) Acides (pH 2.5 à pH 4.5) Métaux (Fe, Zn, Cu…) Gaz dissous (H 2 S, H 2, CO 2, CH 4 ) Anoxie Radiations ionisantes Gradients abrupts Température Concentrations en oxygène Concentrations en composés réduits (H 2 S, H 2, CO 2, CH 4 ) Milieu hydrothermal Milieu côtier Polluants anthropiques Température Eutrophisation (MO)

6 État actuel des connaissances sur le stress oxydatif chez les mollusques marins Très nombreuses études en écotoxicologie utilisant essentiellement - les mesures dactivités denzymes anti-oxydantes (SOD, catalases, …) - le dosage des ROS et du GSH comme biomarqueurs de stress Peu détudes au niveau moléculaire (absence dorganisme modèle, peu doutils moléculaires relatifs au stress oxydant)

7 Les modèles biologiques étudiés Mollusques Annélides Bathymodiolus azoricus Mytilus edulis Crassostrea gigas Alvinella pompejana Paralvinella grasslei Paralvinella sulfincola

8 Approches moléculaires employées: transcriptomie différentielle Approche spécifique Banques SSH Approches globales: Banque cDNA ARNm Control samples Stressed samples Substraction of common genes Up-regulated genes Down-regulated genes tissues ARNm

9 Métaux lourds Pesticides Hydrocarbures Salinité Température Hypoxie Infections bactériennes Tous convergent vers une production de radicaux libres Infections pathologies xénobiotiques hypoxie Stress abiotiques X R n a y Identification des différentes voies de régulation et de détoxication du stress oxydatif Analyses des profils transcriptomiques: recherche des gènes communs ou spécifiques de plusieurs stress Modèle Crassostrea gigas Approches moléculaires employées: transcriptomie différentielle

10 Gènes sur-exprimés (24 jours) Cytoskeleton, structure, matrix Respiratory chain Nucleic acids regulation Detoxification Amino acids metabolism Energetic metabolism Protein regulation Cellular communication, immune system, receptor Stress protein Reproduction Lipids metabolism Development, differenciation Ribosomal protein Unknown functions ESTs Cytochromes P4501A1 SOD HSP70 Gluthatione peroxydase Glutamine synthetase Delta-9-desaturase Arginine kinase Glycogen phosphorylase Anhydrase carbonique BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de lhypoxie Gènes inhibés (24 jours) Gènes inhibés (7-10 jours) Gènes sur-exprimés (7-10 jours)

11 Temps dexposition (jours) Expression relative Metallothionein 4 Protéine de stress Protection cellulaire Fonction anti-oxydante Manteau Delta-9 désaturase Peroxiredoxine 6 Métabolisme lipidique: maintien de la structure membranaire Enzyme antioxydant Manteau Glande digestive BANQUES SSH sur Crassostrea gigas: effets de lhypoxie hypoxie normoxie * Forte variabilité inter-individuelle de lexpression des gènes Expression tissu-specifique * Expression régulée au cours du temps

12 Phase I Oxydation par les monooxygénases Récepteurs Phase II Conjugaison à des composés endogènes Dommages ADN Phase III Elimination active métabolites hydrosolubles H Hydrocarbures (H) métabolites réactifs BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures

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14 0.2 kb M jours T CYP1A1 Phase I Induction * ** jours GST pi GST sigma GST omega GST mu T Phase II RT-PCR Multiplex jours Induction des GSTs mu et omega Inhibition de la GST sigma BANQUES SSH sur C. gigas: effets des hydrocarbures

15 Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant À 15°C Sur expression: Hem IC (Intracellulaire) A 20°C sur expression: Hem L3 (Linker) Hem B1 (Extracellulaire ) À 15°C: sur expression Branchie: MDH, AAT, SDH Corps: Aconitase À 15°C: sur expression Branchie-manteau: GST sigma Branchie: PRX, SOD

16 Réduction de la disponibilité dO 2 Hémoglobines Extracellulaires B1 et A2C Capture et transport dO 2 PO 2 Hémoglobines Intracellulaires IC Réservoir dO 2 Linker L3 Structure Hb Protection contre le ROS Augmentation de Température SOD ? Transfert Bidirectionnel ? 20° C 15° C 20° C Effets de la température sur P. grasslei: induction de stress oxydant

17 Augmentation de la Température 20°C Stress Oxydatif Altération de la stabilité membranaire (peroxydation lipidique) SOD GST PRX ROS RHS Enzymes de protection Aconitase AAT MDH Protéines métaboliques Métabolisme anaérobie?

18 Alvinella pompejana sequencing project 4,000 contigs 9,000 singlets 6,600 with homolog proteins (51%) blastX 49% with no homologs !!! (long ORFs with biased composition)

19 Banques cDNA construites en : ESTs (cDNA libraries): * 9000 unigenes chez Crassostrea gigas * 3500 unigenes chez Mytilus galloprovincialis * 1800 unigenes chez Ruditapes decussatus * 2500 unigenes chez Bathymodiolus azoricus * 2000 unigenes chez Paralvinella grasslei * 9000 unigenes on Alvinella pompejana * 300 unigenes on Lepetodrillus elevatus Puce ADN disponibles ou en construction : * « gigas » micro-array (1500 spots) dédiée au stress: utilisée pour des analyses comparatives en milieu anthropisé. * « gigas » micro-array (9000 spots) C. gigas: collaboration avec le Marine Genomics Europe Program and Aquafirst (IFREMER-INRA) * Autres microarrays: en construction : moules, palourdes, annélides Marine Genomic Europe Network Alvinella Consortium

20 Projets de recherche en cours Transcriptomie comparée Temps [Gène X] PCR quantitative Catalogues de gènes régulés au cours des processus de réponse aux stress (biotiques, abiotiques, anthropiques,…) mais aussi liés aux différents stades de développement Développement de micro-array Intensité du stress et/ou Etude qualitative et quantitative des régulations

21 BIOLOGIE FONCTIONNELLE TRANSCRIPTOMIE: Régulation de lexpression des gènes PHYSIOLOGIE: * activité d enzymes régulées par le stress * Couplages génotype/phénotype (polymorphisme dexpression ou de séquence) * croissance * fitness * détoxication Etude des convergences des réponses au stress sur une échelle évolutive Gradient et nature du stress oxydant Projets de recherche en cours

22 TRANSCRIPTOMIE: Régulation de lexpression des gènes Identification des différentes voies de régulation et de détoxication du stress oxydatif Comparaison inter-espèce(taxons) et/ou inter-stress des profils transcriptomiques: recherche de signatures de régulation communes ou spécifiques Stress D Espèce 4 Stress B Espèce 2 Stress A Espèce 1 Espèce 3 Xw n a Stress C

23 Gène A Gène D Gène J Gène E Gène K Gène G Gène H Gène F Gène C Gène L Gène I Gène B Etude des co-régulations entre gènes Identification de network de gènes = Signatures moléculaires de réponse au stress Projets de recherche en cours TRANSCRIPTOMIE: Régulation de lexpression des gènes

24 Relation génotype-expression de gènes. Ex de Bathymodiolus PGM bas 6 6,5 7 7,5 8 8,5 100/100100/95+95/95 105/ / /95 delta Ct HSP70 PGM haut 5 5,5 6 6,5 7 7, / /90+ 90/90 110/ /90 100/ /86 delta Ct HSP70 Relation entre génotypes allozymiques et expression des ARNm Analyse canonique de redondance: mise en évidence de relation entre le génotype allozymique, lexpression des ARNm, le niveau de protéines de stress (?) et le temps (dexposition et de récupération). HSP70 Ferritine GF2a, yolk, GF2b / MDH haut et bas ; ferritine GF1 / LAP GPI ; anhydrase carbonique / MDH haut GPI ; MT / PGM haut Projets de recherche en cours

25 * Couplages génotype/phénotype (polymorphisme dexpression ou de séquence) Projets de recherche en cours Expression et polymorphisme des gènes Activité protéique variant1 Variant 2 Transformation dans E.coli BL21DE3 Culture en milieu liquide en présence de gammes de stress DO Temps Activation de MT1 5 UT R 1 er cas: présence de faibles concentrations en métaux - 60pb- 90pb MT1 MBF 5 UT R - 170pb MT2 Activation de MT1 5 UT R 2 ième cas: présence de fortes concentrations en métaux - 60pb- 90pb MT1 MBF 5 UT R - 170pb MT2 Activation de MT2 1: TTT GGG GTC AAG 2: TTT GGG CCC AAG

26 Dans quel cadre ? * OUEST-genopole ® (projet fédérateur Mer-Agro-Santé): Génome, adaptation et environnement. Projet 5: Réponse au stress oxydatif chez lhuître Crassostrea gigas en environnement variable : expression et activité denzymes antioxydantes * ANR Genanimal (Cgphysiogen) CNRS IFREMER Universités Bases moléculaires des fonctions physiologiques chez Crassostrea gigas : interaction hôte/pathogène/environnement * Programme Européen « Marine Genomics Europe » Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins. * Coopération franco-chilienne et franco-canadienne

27 Dans quel cadre ? * PRIR « AMETHYST » ( ) : Adaptation Multigénique et Evolution des Taxons HYdrothermaux aux conditions extrêmes de température et danoxie : recherche de Signatures moléculaires convergentes au niveau du Transcriptome * Programme GIS « Alvinella » ( ) Etude de ladaptation des Alvinellides aux conditions de stress thermique et oxydatif de lenvironnement hydrothermal profond * Programme Européen « Marine Genomics Europe »: Etude transcriptomique de la réponse au stress chez les mollusques marins: comparatif hydrothermal-côtier.


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