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Approches méta-génomiques en Microbiologie Pascal SIMONET Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS Laboratoire Ampère, ECL-CNRS

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1 Approches méta-génomiques en Microbiologie Pascal SIMONET Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS Laboratoire Ampère, ECL-CNRS

2 CONTEXTE

3 Eucaryotes microscopiques Procaryotes Whitman et al PNAS, 95, Prokaryotes: The unseen majority. 4-6 x cellules bactériennes 1,2 x Océan 2,6 x Sol 3,5 x Sol profond 0,25 - 2,5 x Sous sol océanique Microorganismes

4 The diversity of life

5 Overview Microbes dans lenvironnement Microorganismes (bactéries, archaea, champignons, levures) colonisent tous les écosystèmes de notre planète. Un gramme de sol de jardin > cellules microbiennes (100 – 1000 espèces différentes). Le corps humain: 1 milliard de cellules microbiennes. Microorganismes: impliqués dans tous les processus globaux Microorganismes: Rôle fondamental en Biotechnologie (e.g., antibiotiques, fermentation, expression, bioremédiation).

6 Despite temperatures ranging from –5 to –70 o C and water contents below 2%, Antarctic terrestrial soils contain 10 6 – 10 8 cells per gram.

7 Large populations of hyperthermophilic bacteria and archaea live in boiling hydrothermal systems.

8 Culture in vitro Collections de microorganismes: - Laboratoires académiques - Organisations privées ou publiques ATTC (USA) LMG (Belgique) DSM (Allemagne) I. Pasteur (France) - Laboratoires industriels Approches traditionnelles en microbiologie

9 Isolats bactériens Problèmes didentification Problèmes de caractérisation Problèmes de taxonomie Problèmes dévolution (transferts latéraux de gènes) Problèmes daccessibilité Problèmes de représentativité (1% de cultivés) Problèmes de conservation Problèmes de criblage

10 ADN microbien « environnemental ». Extraction, Purification, Exploitation Identification, caractérisation, fonctions et exploitation des bactéries non cultivées. Approches « métagénomiques » en microbiologie PRINCIPE

11 Lyse in situ et extraction directe de lADN (total), purification. Extraction des cellules bactériennes, purification, lyse, purification de lADN. Source ? Sélection PCR: Banques de séquences 16S rDNA. Clonage direct: Banques dADN métagénomique Séquençage direct

12 Extraction dADN des bactéries (métagénome) ADN métagénomique vecteur Clonage Transformation dans hôte cultivable Banque dADN métagénomique PCR Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Culture in vitro Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection directe dactivité antibactérienne ou enzymatique Détection de gènes par hybridation Séquençage direct (shotgun)

13 Création et exploitation de banques dADN métagénomique Renaud NALIN 3 rue des Satellites Toulouse

14 ATOUTS et LIMITES

15 Génomique: Définition C'est l'étude exhaustive des génomes et en particulier de l'ensemble des gènes, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur fonction et de leur rôle. Séquençage massif, Méthodes bio-informatiques Post-génomique Sciences en « iques », transcriptomique, protéomique, métabolomique etc…

16 « Méta -génomique » en Microbiologie ?? Sensu strictonon, mais… Sensu lato Utilisation de lADN oui

17 Eaux de drainage des mines de fer Couverture par banque dADN métagénomique de 80 x10 6 pb ( clones) Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43

18 Eaux de drainage des mines de fer Couverture par banque dADN métagénomique de 80 x10 6 pb ( clones) Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, Sols cultivés ou forestiers: 10 9 cellules par gramme espèces génomiques dominantes différentes 9 millions de clones (pour des inserts moyens de 40 kb) nécessaires pour un représentant de chaque espèce. Banque métagénomique dun sol de prairie ( clones) Taille totale de lADN cloné : 3,5 x 10 9 pb 5% de la diversité totale (x24 /techniques de culture) Ginolhac A et al. (2003) Appl Environ Microbiol 70,

19 Extraction et purification de lADN environ. Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X. and Simonet P Quantification of Bias Related to the Extraction of DNA Directly from Soils. Appl. Environ. Microbiol., 65 : Lyse cellulaire ?? Taux de récupération de lADN ??

20 APPLICATIONS

21 Extraction dADN des bactéries (métagénome) ADN métagénomique vecteur Clonage Transformation dans hôte cultivable Banque dADN métagénomique PCR Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Culture in vitro Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection directe dactivité antibactérienne ou enzymatique Détection de gènes par hybridation Séquençage direct (shotgun)

22 Criblage moléculaire dune banque dADN métagénomique par hybridation de colonies

23 La structure des polyketides produits par les PKSI est liée à leur organisation linéaire en domaines et modules. Type I PKS (PKSI)

24 Criblage de banques dADN métagénomique (sol) clones139 « KS » « KS » séquencésPas de redondance Nouveauté totale (similarité < 67%) Ginolhac A., Jarrin C., Gillet B., Robe P., Pujic P., Tuphile K., Bertrand H., Vogel T. M., Perriere G., Simonet P., and Nalin R Phylogenetic Analysis of Polyketide Synthase I Domains from Soil Metagenomic Libraries Allows Selection of Promising Clones. Appl. Environ. Microbiol. 2004;

25 Extraction dADN des bactéries (métagénome) ADN métagénomique vecteur Clonage Transformation dans hôte cultivable Banque dADN métagénomique PCR Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Culture in vitro Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection directe dactivité antibactérienne ou enzymatique Détection de gènes par hybridation Séquençage direct (shotgun)

26 Streptomyces coelicolor Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens Escherichia coli Vecteurs

27 A second generation snp-derived Escherichia coli–Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation Nikodinovic, Priestley, Plasmid 56 (2006) 223–227 Criblage chimique Banques dADN métagénomique ou

28 Extraction dADN des bactéries (métagénome) ADN métagénomique vecteur Clonage Transformation dans hôte cultivable Banque dADN métagénomique PCR Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Culture in vitro Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection directe dactivité antibactérienne ou enzymatique Détection de gènes par hybridation Séquençage direct (shotgun)

29 Venter et al Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science 304, espèces génomiques 148 phylotypes bactériens inconnus

30 MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No –5630 MetaGene can predict a whole range of prokaryotic genes based on the anonymous genomic sequences of a few hundred bases, with a sensitivity of 95% and a specificity of 90% for artificial shotgun sequences (700 bp fragments from 12 species). Hideki Noguchi*, Jungho Park and Toshihisa Takagi Department of Computational Biology, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, Kashiwa, Chiba , Japan

31 Extraction dADN des bactéries (métagénome) ADN métagénomique vecteur Clonage Transformation dans hôte cultivable Banque dADN métagénomique PCR Clonage séquençage RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage chimique Criblage biologique Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Culture in vitro Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection directe dactivité antibactérienne ou enzymatique Détection de gènes par hybridation Séquençage direct (shotgun)

32 Fortes teneurs en métaux lourds « Sols » chimiquement déséquilibrés Ni Cr, Co, C, N, P … Carence en éléments essentiels Modèle : Déblais de mines de nickel en Nouvelle-Calédonie Gènes de résistance au nickel Fall, Herrera, Helassa, Bernillon, Simonet, Vogel, Navarro

33 Banques plasmidiques Taille des fragments : 2-9KbTaille des fragments : 20-40Kb Banques cosmidiques 50Kb 2 clones MS1 et MS2 8 mM 3 clones MS3, MS7 et MS43 8 mM

34 ORF1ORF2ATPase E1-E2 nreAnre B HP RT MS3 DedANicOchrBnreBrcnAnreAORF1ORF2chrAwcaK MS7/43 ORFs impliqués dans la résistance au nickel : nreB - rcnA

35 Determining the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach Diaz-Torres et al FEMS Microbiol Lett 258, 257–262 Bouche: Prévalence de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques

36 Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortium Woyke et al. 2006, Nature Vol 443, 26 October 2006 Olavius algarvensis, (vers marin) Microsymbiontes remplacent bouche et tube digestif Microbial diversity in the deep sea and the underexplored rare biosphere Sogin et al. 2006, PNAS vol. 103 no –12120 Grande profondeur : Complexité jusquà 2 ordres de grandeur > autres environnements. Des milliers de populations faiblement représentées Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities Culley et al. 2006, SCIENCE VOL JUNE 2006 Océans: un réservoir de virus à ARN inconnus

37 Comparative Metagenomics of Microbial Communities Tringe, 1,2 * von Mering,3 * Kobayashi, 1 Salamov, 1 Chen, 4 Chang, 5 Podar, 5 Short, 5 Mathur, 5 Detter, 1 Bork, 3 Hugenholtz, 1 Rubin 1,2. 1 Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute, 2800 Mitchell Drive, Walnut Creek, CA 94598, USA. 2 Lawrence Berkeley National Laboratory, Genomics Division, Berkeley, CA 94720, USA. 3 European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, Heidelberg, Germany. 4 University of California, Berkeley, Department of Electrical Engineering and Computer Science, Berkeley, CA 94720, USA. 5 Diversa Corporation, 4955 Directors Place, San Diego, CA 92121, USA 22 APRIL 2005 VOL 308 SCIENCE « The identification of environment-specific genes through a gene-centric comparative analysis presents new opportunities for interpreting and diagnosing environments. »

38 Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. A reduced complexity of the bacterial phylum Firmicutes as a signature of the faecal microbiota in patients with CD. Presence of new bacterial species. Six healthy donors and six patients with CD. Bacterial diversity (16S rRNA gene). Gut Feb;55(2): C Manichanh, L Rigottier-Gois, E Bonnaud, K Gloux, E Pelletier, L Frangeul, R Nalin, C Jarrin, P Chardon, P Marteau, J Roca and J Dore INRA, Genoscope, Genopôle IP, LibraGen etc

39 ADN environ.Ecologie µbienne Environ. Détecter, identifier, localiser, compter les µorganismes. Identifier des gènes / Déterminer des activités potentielles. Exploiter des ressources génétiques. Applications méta-génomique?

40

41 Improved inverse PCR scheme for metagenome walking Taku Uchiyama and Kazuya Watanabe Marine Biotechnology Institute, Kisarazu, Japan BioTechniques 41: (August 2006)


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