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Pharmacologie Moléculaire 2 Magali Waelbroeck E1.6.207.

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1 Pharmacologie Moléculaire 2 Magali Waelbroeck E

2 43 SLIDES 2 But du cours: Vous permettre de comprendre, au vu des figures dans un article, pourquoi lexpérience a été faite et quelle conclusion on peut en tirer.

3 43 SLIDES 3 Moyens: Apprendre à traduire une description (phrase) en modèle (équation stoechiométrique), en déduire les prévisions vérifiables, et en vérifier la validité thermodynamique. Chercher vous-mêmes la réponse à quelques questions…

4 43 SLIDES 4 Outils utilisés dans ce cours: Programmes: oGraph Pad: utilisation et interprétation des données expérimentales ou simulées. Commentaires: voir oSpdbv ou Deep View: visualisation des structures protéiques téléchargées de la Protein Data Bank. Utilisation: voir le tutorial de Gale Rhodes oExcell: simulation de résultats attendus

5 43 SLIDES 5 Voici quatre représentations dune même protéine. Sur lesquelles peut on voir: Le tracé de la chaine polypeptidique? Les liens Hydrogènes qui stabilisent la structure? Le volume occupé réellement par la protéine? Les chaines latérales des acides aminés? Le type dacide aminé (Basique, acide, hdrophobe, polaire)? La structure primaire? Secondaire? Tertiaire? Quaternaire? La position du ou des ligands?

6 43 SLIDES 6 A B C D

7 7 Quelles sont les relations entre affinité et cinétiques? Définition du terme affinité oQuest-ce qui permet ou explique une liaison de forte affinité? Définition du terme spécificité oPourquoi dit-on quun enzyme, un récepteur, un ligand est très spécifique de… Définition du terme cinétique oQuest-ce qui explique une liaison rapide ou lente? Une dissociation rapide ou lente?

8 43 SLIDES 8 Chemin réactionnel R.D R+D Energie Libre Thermodynamique:

9 43 SLIDES 9 R.D R+D Thermodynamique: Chemin réactionnel Energie Libre

10 43 SLIDES 10 Collisions: Phase aqueuse, T° pièce : Collisions: M -1 sec M -1 min -1 k on typiques: petites molécules: M -1 min -1 protéine-protéine: 10 5 M -1 min -1 Protéines: peu de collisions productives:

11 43 SLIDES 11 Relations vitesse - affinité? Hypothèse: association reflète probabilité collisions ligand -récepteur oVitesse association constante, oDissociation lente haute affinité; dissociation rapide basse affinité oK D proportionnelle à k off

12 43 SLIDES 12 Vérification: mesure du k on de différents couples ligand - récepteurs Trop petits: pas visibles. Échelle log?

13 43 SLIDES 13 k on : comparaison de différents ligands, différents récepteurs 3 logs: 1000 x Conclusion: k on très variable: notre hypothèse était fausse. Pourquoi?

14 43 SLIDES 14 R β-adrenergiquek on (10 8 M -1 min -1 ) k off (min -1 ) pK D t 1/2 (min) (-) pindolol (+) pindolol (-)CGP (+)CGP (-)ICYP (+)ICYP (-)carazolol (+)carasolol (-)IHYP (+)IHYP Premier indice: comparaison de la vitesse dassociation dénantiomères

15 43 SLIDES 15 Muscarinique (M2) k on (10 8 M -1 min -1 ) k off (min -1 ) pK D t 1/2 (min) (R)-QNB (S)-QNB (R)-Met QNB (S)-Met QNB Muscarinique (M3) (R)-QNB0.11<<0.0009<<10.0>>360 (S)-QNB (R)-Met QNB (S)-Met QNB

16 43 SLIDES 16 Données à expliquer: k on dépend (un peu) du ligand, k on dépend (beaucoup) du récepteur, k on presque identique si énantiomères, k off détermine laffinité relative des énantiomères…

17 43 SLIDES 17 Kinetic Tuning of the EF-Hand Calcium Binding Motif: The Gateway Residue Independently Adjusts (i) Barrier Height and (ii) Equilibrium Steven K. Drake and Joseph J. Falke* Department of Chemistry and Biochemistry, University of Colorado, Boulder, Colorado Biochemistry, 35 (6), , Abstract: In EF-hand calcium binding sites of known structure, the side chain provided by the ninth EF-loop position lies at the entrance of the shortest pathway connecting the metal binding cavity to solvent. The location of this residue suggests that it could serve as a "gateway", providing steric and electrostatic control over the kinetics of Ca 2+ binding and dissociation.

18 43 SLIDES 18 Galactose Binding Protein: Galactose Ca 2+

19 43 SLIDES 19 Galactose binding protein: E-F Hand (« main E-F ») Ca +2 Asp Asn Lys (groupe C=O chaine polypeptidique) Ca +2 « pouce » « index » « paume »

20 43 SLIDES 20 To test this hypothesis, the present study has engineered the putative gateway side chain of a model EF-hand site and determined the resulting effects on metal ion affinity and dissociation kinetics. The model site chosen was that of the Escherichia coli galactose binding protein (GBP), in which the putative gateway is a Gln side chain.

21 43 SLIDES 21 Calcium binding E-F Hand (gate closed) Calcium binding E-F Hand (gate open) Gln « gate keeper » « Gate » Gln « gate keeper » « Gate » Galactose binding protein: Calcium binding site

22 43 SLIDES 22 Two control substitutions at the fourth EF-loop position, a noncoordinating surface residue, had no significant effect on either the equilibrium or the kinetics of the model site. The remaining seven proteins, which possessed unique substitutions at the ninth EF-loop position (Glu, Asn, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala), in each case significantly altered the affinity or dissociation kinetics of the site for Tb 3+, used as a probe metal ion.

23 43 SLIDES 23 1 Einstein = 1 mol de photons 1 kcal = 4,1868 kJ Fluorescence? Lumière = Énergie:

24 43 SLIDES 24 Rappel: orbitales liantes et antiliantes liantesantiliantes ( ou ) 2s * 2 2 * 1p * 1 1 * Energie

25 43 SLIDES 25 Fluorescence, phosphorescence Fluorescence: réémission de lumière immédiate; Phosphorescence: isomérisation du spin des e - : réémission lente.

26 43 SLIDES 26 FRET Lénergie dégagée par le donneur est absorbée directement par laccepteur, puis réémise sous forme de photons de plus longue λ λ (nm) Excitation Emission ________ Donneur Accepteur

27 43 SLIDES 27 3 Tryptophanes (accepteurs) (fluorescents) à Å du Tb 3+ Terbium (donneur) phosphorescent

28 43 SLIDES 28 GATE:K D (µM)k off (sec -1 ) k on (µM -1 sec -1 ) Glutamate: -CH 2 -CH 2 -COO Aspartate: -CH 2 -COO Glutamine- (wt) -CH 2 -CH 2 -CONH Serine: -CH 2 OH Threonine: -CHOH-CH Asparagine: - CH 2 -CONH Glycine: -H Alanine: -CH

29 43 SLIDES 29 Ca 2+ + EF-handEF-hand-Ca 2+ N,G,A S,T Q Chemin réactionnel Ca 2+ + EF-handEF-hand-Ca 2+ D D Liaison association Q Q dissociation E E Energie Libre

30 43 SLIDES 30 Comment pourrait-on traduire par un modèle stoechiométrique les expressions suivantes? Le ligand reconnaît le récepteur. Lagoniste reconnaît le récepteur, qui sactive (laisse passer les ions Na +, Ca 2+, ou Cl - ) Les benzodiazépines reconnaissent un site accessoire sur le récepteur du GABA, facilitent la reconnaissance de ce dernier, et permettent louverture du canal Cl - Lagoniste reconnaît le récepteur, qui recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. oPourrait-il favoriser la formation dun complexe de basse affinité? oEnsuite, le récepteur est reconnu par larrestine et internalisé.

31 43 SLIDES 31 Rappel: Liaison à un site: Peut-être suivie immédiatement par sa re-dissociation: Lassociation du radioligand : A léquilibre, les deux réactions se compensent exactement :

32 43 SLIDES 32 Cinétique de dissociation: Beaucoup plus simple à étudier: une seule réaction doit être considérée: -k off Sur une échelle log: Sur une échelle linéaire:

33 43 SLIDES 33 Cinétique dassociation (1): La réaction dassociation: Integration difficile puisque R, F et B varient simultanément:

34 43 SLIDES 34 Il est plus facile de calculer la vitesse de diminution de R en F constant: R disparaît donc avec une constante de vitesse apparente: k obs =k on F+k off Cinétique dassociation : (2)

35 43 SLIDES 35 Cinétique dassociation : (3) Que se pase-t-il si la [Traceur] augmente?

36 43 SLIDES 36 Cinétique dassociation : (4) linéarisation

37 43 SLIDES 37 Cinétique dassociation : (5) évaluation de k on, k off La constante de vitesse dassociation apparente, k obs, augmente proportionnellement à F k off k on

38 43 SLIDES 38 Que se passe-t-il si deux ligands entrent en compétition pour le récepteur?

39 43 SLIDES 39 Cinétique de liaison: traceur lent et compétiteur rapide

40 43 SLIDES 40 Cinétique de liaison: deux énantiomères: traceur lent et compétiteur très rapide

41 43 SLIDES 41 Cinétique de liaison: traceur très rapide et compétiteur lent

42 43 SLIDES 42 Cinétique de liaison: traceur racémique

43 43 SLIDES 43 Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. Ensuite, le récepteur est reconnu par larrestine et internalisé. Le complexe Agoniste-Récepteur recrute une protéine G pour former un complexe de haute affinité. Ensuite, le récepteur est reconnu par larrestine et internalisé. Il suffit que k -2 soit <


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