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Dyskératose congénitale et biogénèse des RNA H/ACA. Christian Trahan et François Dragon, Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM.

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1 Dyskératose congénitale et biogénèse des RNA H/ACA. Christian Trahan et François Dragon, Centre BioMed, Département des sciences biologiques, UQÀM.

2 Pathologie qui affecte les tissus à haut renouvellement diagnostique difficile en raison des désordres variés: Hyperpigmentation de la peau (89%) Dysplasie des ongles (88%) Aplasie de la moelle osseuse (86%) Leucoplasies des muqueuses (78%) Pathologies pulmonaires (20%) Perte prématurée des cheveux (16%) Tendance à la malignité (10%) Ostéoporose (10%) Aplasie de la moelle osseuse (86%) Dyskératose congénitale (DC)

3 Petite stature /retard de développement microcéphalie épiphora Hypoplasie cérébellaire Nécrose avasculaire des hanches et des épaules Problèmes gastroentérique Déficiences immunologique Perte prématurée des dents Autres désordres … autres…

4 Dyskératose congénitale (DC) Raccourcissement des télomères transmis à chaque génération. La DC est donc considéré comme un problème de la biologie des télomères. Corrélation entre la longueur des télomères et lapparition des phénotypes. Des mutations génétiques ont été identifiés chez environ la moitié des individus répertoriés au DCR Les gènes impliqués ont en commun la biologie des télomères:

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6 Dyskératose congénitale (DC) Forme autosomique dominante; mutations dans le RNA de la télomérase (hTR). Forme récessive reliée à lX; mutations dans dyskérine. Formes autosomique récessives; mutations dans NHP2 et NOP10.

7 DNA télomérique [TTAGGG]n [AATCCC]n 2-30 kpb b 3 5 [TTAGGG]n [AATCCC]n T-loop D-loop 5 3 Problème de réplication des extrémités chromosomiques fourche de réplication 3 5 synthèse du brin avancé 3 5 Synthèse du brin retardé Extension et dégradation des amorces Télomères et problème de réplication

8 Transcriptase inverse (hTERT) RNA (hTR) 3 5 CAAUCCCAAUC Transcriptase inverse (hTERT) RNA (hTR) 3 5 CAAUCCCAAUC Extension des télomères par la télomérase b GGTTAGGGTTAG GGTTAG n GGTTAG

9 Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC. snoRNA scaRNA rRNA snRNA ψψ

10 GAR1 NAF1 (3) (2) CTD polII dyskérine NOP10 NHP2 Nucléole, Corps de Cajal Cytoplasme Noyau Site de transcription des RNA H/ACA NAF1 (1) Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo. Protéines H/ACA

11 Élaboration dun système détude in vitro. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 Inv C408G

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15 Méthodologie Transcription/traduction in vitro ( 35 S-méthionine) NAF1 Dyskérine Fibrillarine CTRL- NHP2 NOP10 IP dyskérine ou NAF1 SDS-PAGE 4-12% fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX. Analyse des RNA sur Molecular Imager FX 35 S transparent Analyse surnageantsSDS-PAGE 4-12% Transcription in vitro ( 32 P-CTP) hTR204 hTR204 mutés U3 RNA CTRL- Purification sur gel IP dyskérine ou NAF1

16 Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 sassemble correctement NAF1 Dysk. fibrillarine NHP2 NOP10 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 fibrillarine NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP - NAF1 - NHP2 - NOP10 - NAF1, NOP10 - NAF1, NHP2 - dysk. Toutes IP dyskérine

17 Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

18 NAF1 requiert la présence du trimère pour sassocier à hTR204. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

19 NAF1 requiert la présence du trimère pour sassocier aux RNA H/ACA NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

20 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR. NAF1 dyskérine NOP10 NHP2

21 Conclusions Nous avons élaboré un système de reconstitution in vitro qui récapitule lassemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis danalyser leffet des mutations dans ce domaine sur lassemblage de la RNP. Nous démontrons pour la première fois que la délétion Δ ainsi que la mutation ponctuelle C408G abolissent la liaison du tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 au domaine H/ACA de hTR. Nos résultats suggèrent que les mutations C408G et Δ engendrent des défauts dassemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC. Aucun défaut dassemblage nest causé par la mutation C450A na pu être détecté dans notre système.

22 Perspectives

23 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

24 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

25 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

26 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

27 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

28 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

29 NAF1 dyskérine NOP10 NHP2 La transversion C408G et la délétion Δ empêchent lassemblage du domaine H/ACA de hTR.

30 Conclusions

31 perspectives

32 Méthodologie Transcription/traduction in vitro ( 35 S-méthionine) NAF1 Dyskérine Fibrillarine CTRL- NHP2 NOP10 IP dyskérine ou NAF1 SDS-PAGE 4-12% fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX. Analyse des RNA sur Molecular Imager FX 35 S transparent Analyse surnageantsSDS-PAGE 4-12% Transcription in vitro ( 32 P-CTP) hTR204 hTR204 mutés U3 RNA CTRL- Purification sur gel IP dyskérine ou NAF1

33 hTR WThTR-G450A Mature 3end 3 genomic sequence Mature 3end 3 genomic sequence TGCAGTTCGCTTTCC…frequencyTACAGTTCGCTTTCC… frequency TGC1/9TAC 4/9 TGCA2/9TAC AG1/9 TGCAA1/9TAC AGAA1/9 TGCAAAA1/9TAC AAAA1/9 TGCAGAAA1/9TAC AGTTC1/9 TGCAGTTCGCT2/9TAC AGTTCGCT1/9 TGCAGTTCGCTT1/9

34 HeLaBeWo Mature 3end 3 genomic sequencefrequency Mature 3end 3 genomic sequencefrequency TGCAGTTCGCTTTCC…TGCAGTTCGCTTTCC… TGC6/11TGC9/12 TGC A 2/11TGC A 1/12 TGC AG 1/11TGC AAAAA 1/12 TGC AGAAAAA 1/11TGC AGTA 1/12 TGCAAAAAA1/11

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36 Conclusions

37 perspectives

38 Remerciements François Dragon, Directeur les membres du laboratoire Yves Henry, CNRS Toulouse. Lapins Néo-Zélandais blanc Caroline Martel, assistante de recherche. Chantal Autexier, McGill. Gabriele Varani and Steve Reichow, University of Washington


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