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Le diagnostic préimplantatoire (DPI) Couplé au typage HLA Service de génétique médicale Hôpital Necker-Enfants Malades Paris Paris Philippe BURLET.

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1 Le diagnostic préimplantatoire (DPI) Couplé au typage HLA Service de génétique médicale Hôpital Necker-Enfants Malades Paris Paris Philippe BURLET

2 Partie I QUEST CE QUE LE DPI AVEC TYPAGE HLA ?

3 Historique - Première naissance après FIV à Londres en 1978

4

5

6 Historique - Première naissance après FIV à Londres en Première naissance après FIV à Paris en 1982

7 AMANDINE

8

9 Historique - Première naissance après FIV à Londres en Première naissance après FIV à Paris en Première naissance après DPI à Londres en 1992

10 Pr ALAN HANDYSIDE

11

12 Historique - Première naissance après FIV à Londres en Première naissance après FIV à Paris en Première naissance après DPI à Londres en Première naissance après DPI à Paris en 2000

13 Valentin

14 Historique - Première naissance après FIV à Londres en Première naissance après FIV à Paris en Première naissance après DPI à Londres en Première naissance après DPI à Paris en Première naissance après DPI-HLA à Chicago en 2000

15 ADAM

16 Historique - Première naissance après FIV à Londres en Première naissance après FIV à Paris en Première naissance après DPI à Londres en Première naissance après DPI à Paris en Première naissance après DPI-HLA à Chicago en Première naissance après DPI-HLA à Paris en 2011

17

18 3 centres en France : PARIS STRASBOURG MONTPELLIER

19 Obstétriciens Obstétriciens Sage femme Sage femme Généticien Cytogénéticien Cytogénéticien Biologiste Moléculaire Biologiste Moléculaire Biologiste de la Reproduction Biologiste de la ReproductionPsychologue Pédiatre Hématologue Hématologue Centre de DPI Pluridisciplinaire Centre de DPI Pluridisciplinaire

20 - -Anomalie(s) responsable(s) préalablement identifiées - -Recherche uniquement de cette anomalie La législation française - Autorisé quà titre exceptionnel - maladie génétique dune particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic Loi de bioéthique de 1994 :

21 Le 06 août 2004 : extension au DPI + HLA et Huntington (test dexclusion) le diagnostic a pour seuls objets de rechercher la maladie génétique d'une part, et de permettre l'application de la thérapeutique, d'autre part. La réalisation du diagnostic est soumise à la délivrance d'une autorisation par l'Agence de la biomédecine

22 Le DPI pour qui ?

23 Quelques maladies autosomiques récessives Mucoviscidose - Amyotrophie spinale - Drépanocytose - Bêta- thalassémie - Ataxie de Friedreich –Maladie de Tay-Sachs - Nanisme diastrophique - Polykystose rénale autosomique récessive - Epidermolyse Bulleuse

24 Quelques maladies autosomiques dominantes Dystrophie myotonique de Steinert – STB -Neurofibromatose - Maladie de Huntington - Achondroplasie - Atrophie optique dominante - Currarino - Charcot-Marie Tooth type 1A - Brachydactylie - Maladie de Hirschsprung - Maladie de von Hippel-Lindau - Néoplasie endocrinienne multiple - Ostéogénèse imparfaite - Rétinoblastome héréditaire -

25 Quelques maladies liées à l'X Syndrome de l'X fragile - Myopathie de Duchenne et Becker - Hémophilie - Syndrome de Wiscott Aldrich - Syndrome de Lesch-Nyhan - Rétinite pigmentaire lié à l'X - Pelizaeus Merzbacher - Myopathie myotubulaire - Maladie de Fabry - Incontinentia pigmenti - Hydrocéphalie liée à l'X - Maladie de Hunter - Déficit en OTC -

26 Quelques maladies mitochondriales NARP – MERF - MELAS

27 Diagnostic dexclusion Huntington, CADASIL, …

28

29 Les autres formes de DPI DPI chromosomique PGS Sexing

30 DPI chromosomique

31 Aneuploïdie screening Âge maternel avancé Avortements spontanés Fausses couches répétées

32 « Sexing »

33 CGH array Harper 2011

34 Le DPI/HLA dans le monde Anémie de Fanconi drépanocytose Béta/alpha Thalassémie Syndrome Wiscott-Aldrich X-ALD Hyper IGM syndrome Dysplasie ectodermique hypohydrotique Syndrome dOmen Ataxie télangiéctasie Granulomatose chronique Neutropénie congénitale sévère

35 Les demandes de DPI / HLA DrépanocytoseBéta-thalassémieBéta-thal/drépano Anémie de Fanconi Alpha thalassémie Autres ( granulomatose septique chronique, Schwachman-Diamond)

36 « preimplantation HLA typing » Leucémies Leucémies Blackfan Diamond Blackfan Diamond Wiscott Aldrich Wiscott Aldrich

37 En 2010, cela fait vingt ans que le DPI existe et cycles ont été effectués dans le monde. Les mille premières naissances ont été atteintes en On peut compter près de naissances. A peu près un quart des cycles de DPI effectués le sont pour des maladies monogéniques. Le taux de grossesse après DPI est de 22%.

38 Partie II Les étapes du DPI

39

40 Stimulation ovarienne hormones ovaire

41 Décapeptyl 3,0 mg, IM Env. 3 semaines Pendant les règles ou à J18-22 ponction transfert Traitement de stimulation Inhibition de lhypophyse : blocage de la fonction ovarienne Stimulation de la fonction ovarienne Schéma thérapeutique Agoniste Retard (DPI) hCGovulation Environ 12 jours Contrôles (prises de sang + échographies) 3-5 fois pendant cette période à Béclère biopsie

42 ovulation ovocyte

43 Ponction ovocytaire

44

45 ICSI ovocyte

46 ICSI ovocyte

47

48

49 Le clivage du zygote ovocyte

50 Le clivage du zygote 2 pronucléi

51 Le clivage du zygote 2 blastomères 2 pronucléi

52 Le clivage du zygote 2 blastomères 4 blastomères 2 pronucléi

53 Le clivage du zygote 2 blastomères 4 blastomères 8 blastomères 2 pronucléi

54 biopsie 8 blastomères

55 biopsie 8 blastomères Laser

56

57 biopsie 8 blastomères Laser

58 2 blastomères 8 blastomères biopsie

59 Lyse des blastomères

60

61

62

63 Extraction dADN

64 Amplification pan-génomique Multiple Displacement Amplification

65 PCR PCR Mutation Marqueurs HLA

66 Détermination des embryons sains Mutation Marqueurs HLA

67 Détermination des embryons sains Mutation Marqueurs HLA +++--

68 Détermination des embryons sains Mutation Marqueurs HLA +++--

69 Détermination des embryons sains Mutation Marqueurs HLA

70 Détermination des embryons compatibles Mutation Marqueurs HLA

71 Détermination des embryons compatibles Mutation Marqueurs HLA

72 Détermination des embryons compatibles Mutation Marqueurs HLA

73 Transfert des embryons

74

75 Grossesse

76

77 Naissance

78 Naissance

79 Greffe

80 guérison

81 Embryons HLA compatible 16-17% (25% attendu) et non atteint (11% contre 18% attendu) Take home baby rate = 9% Take home baby rate = 9% Résultats

82 Partie II LE DIAGNOSTIC MOLECULAIRE

83 La PCR

84 Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed every year. Art is subject to arbitrary fashion, religion is inwardly focused and driven only to sustain itself, law shuttles between freeing us and enslaving us.

85 La PCR

86

87 Méthodes danalyse Le gel dagarose Le séquenceur

88 Méthodes danalyse Les fragments dADN sont chargés négativement. Placés dans un champ électrique, ils vont se déplacer de la cathode vers lanode. Plus les fragments sont petits, plus ils vont migrer rapidement.

89 Le peu de matériel biologique disponible Les difficultés du DPI Analyse génétique 1-2 cellules/embryon 10 Millions de cellules Extraction d ADN Analyse Génétique DPI DPN

90 Le peu de temps pour le diagnostic Les difficultés du DPI Rendu des résultats en 24h pour transfert à J4 Rendu des résultats en une semaine DPI DPN

91 Les risques de contamination Les difficultés du DPI Spermatozoïde Cellules du manipulateur Cellules de la mère Fragment dADN (amplification précédente)

92 La qualité des embryons Les difficultés du DPI Absence de noyau Noyau en dégénérescence / mauvaise morphologie Pas de diagnostic CMCM CNCN

93 Les difficultés du DPI allele drop out

94 Détermination des embryons compatibles Mutation Marqueurs HLA

95 deux méthodes alternatives utilisées : Analyse directe : Analyse directe : détection de la MUTATION détection de la MUTATION Analyse indirecte : Analyse indirecte : utilisation de MARQUEURS polymorphes utilisation de MARQUEURS polymorphes DPI - Stratégies

96 Lanalyse préalable

97

98

99

100

101

102 LA REGION HLA Chromosome 6

103 LA REGION HLA 6 p 21

104 LA REGION HLA Class I Class II HLA-A HLA-C HLA-B HLA-DQ HLA-DP HLA-DR

105 LA REGION HLA Class I Class II HLA-A HLA-C HLA-B HLA-DQ HLA-DP HLA-DR D6S276 D6S276 D6S1624 D6S510 D6S2972 D6S273 D6S1666 D6S2876 D6S2874 D6S2749 D6S1618 D6S1560 D6S439 D6S1610 D6S1615 D6S426 D6S265

106 Le « génotypage » HLA A B C D B D A D A C B C 1/4

107 La drépanocytose A S S S A S S A A A 3/4

108 TYPAGE HLA ET DREPANOCYTOSE A B C D B D A D A C B C DREPANO 3/ HLA 1/4 3/16

109 DPI et HLA dossiers agence (2010) 19 dossiers constitués 15 drépanocytose 15 drépanocytose 4 béta-thalassémie 4 béta-thalassémie 17 dossiers autorisés 2 dossiers incomplets 4 grossesses spontanées 7 transferts 11 couples 15 stim débutés 59 embryons 3 compatibles 3 enfants, 1 compatible 4 non compatibles

110 QUESTIONS ETHIQUES

111 Risque dinstrumentalisation de la vie de cet enfant.

112 Risque que lenfant décède avant la naissance du bébé compatible Risque que la greffe échoue Risque de négligence pour les frères et sœurs

113 Alternatives thérapeutiques : pas encore fiables (banques de donneurs) Les embryons sains non HLA compatibles? la loi interdit un 2ème DPI tant quil reste des embryons sains transférables Risque de dérives ? : la Loi française qui encadre le DPI est très stricte

114 Augmenter les possibilités ne force personne à effectuer un choix qui heurte sa morale. M. Onfray

115 LA FAMA NECKER – BECLERE Génétique moléculaire P. Burlet P. Burlet N. Gigarel N. Gigarel J. Steffann J. Steffann A. Munnich A. MunnichCytogénétique M. Le LorchM. Le Lorch S. RomanaS. Romana M. VekemansM. Vekemans Hôpital Necker Biologie de la reproduction R. FrydmanR. Frydman N. FrydmanN. Frydman L.HestersL.Hesters A.BenachiA.Benachi G.TachdjianG.TachdjianHôpital Antoine-Béclère


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