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Le diagnostic préimplantatoire (DPI)

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1 Le diagnostic préimplantatoire (DPI)
Couplé au typage HLA bonjour Merci de me donner l’occasion de presenter notre travail sur le DPI couplé au typage HLA. Service de génétique médicale Hôpital Necker-Enfants Malades Paris Philippe BURLET

2 Qu’est ce que le DPI avec typage hla ?
Partie I Qu’est ce que le DPI avec typage hla ? Analyse génétique d’un embryon âgé de trois jours

3 Historique - Première naissance après FIV à Londres en 1978
La première naissance par DPI a eu lieu a londres pour un diagnostic de mucoviscidose en 1990.

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6 Historique - Première naissance après FIV à Londres en 1978
- Première naissance après FIV à Paris en 1982 La première naissance par DPI a eu lieu a londres pour un diagnostic de mucoviscidose en 1990.

7 AMANDINE

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9 Historique - Première naissance après FIV à Londres en 1978
- Première naissance après FIV à Paris en 1981 - Première naissance après DPI à Londres en 1992 La première naissance par DPI a eu lieu a londres pour un diagnostic de mucoviscidose en 1990.

10 Pr ALAN HANDYSIDE

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12 Historique - Première naissance après DPI à Paris en 2000
- Première naissance après FIV à Londres en 1978 - Première naissance après FIV à Paris en 1981 - Première naissance après DPI à Londres en 1992 - Première naissance après DPI à Paris en 2000 La première naissance par DPI a eu lieu a londres pour un diagnostic de mucoviscidose en 1990.

13 Valentin

14 Historique - Première naissance après DPI à Paris en 2000
- Première naissance après FIV à Londres en 1978 - Première naissance après FIV à Paris en 1981 - Première naissance après DPI à Londres en 1992 - Première naissance après DPI à Paris en 2000 - Première naissance après DPI-HLA à Chicago en 2000 La première naissance par DPI a eu lieu a londres pour un diagnostic de mucoviscidose en 1990.

15 ADAM

16 Historique - Première naissance après DPI à Paris en 2000
- Première naissance après FIV à Londres en 1978 - Première naissance après FIV à Paris en 1981 - Première naissance après DPI à Londres en 1992 - Première naissance après DPI à Paris en 2000 - Première naissance après DPI-HLA à Chicago en 2000 La première naissance par DPI a eu lieu a londres pour un diagnostic de mucoviscidose en 1990. - Première naissance après DPI-HLA à Paris en 2011

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18 3 centres en France : PARIS STRASBOURG MONTPELLIER

19 Centre de DPI Pluridisciplinaire
Obstétriciens Sage femme Généticien Cytogénéticien Biologiste Moléculaire Biologiste de la Reproduction Psychologue Pédiatre Hématologue Centre de DPI Pluridisciplinaire

20 La législation française
Loi de bioéthique de 1994 : - Autorisé qu’à titre exceptionnel - maladie génétique d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic Anomalie(s) responsable(s) préalablement identifiées Recherche uniquement de cette anomalie Le dpi a été autorisé par la loi de bioéthique de 1994, mais les decret n’ont pu etre appliqués qu’en Le dpi est une pratique autorisee mais a titre exeptionel pour des maladies d’une particuliere gravite. Cette maladie doit etre incurable au moment du diagnostic.

21 Le 06 août 2004 : extension au DPI + HLA et Huntington (test d’exclusion)
le diagnostic a pour seuls objets de rechercher la maladie génétique d'une part, et de permettre l'application de la thérapeutique, d'autre part. La réalisation du diagnostic est soumise à la délivrance d'une autorisation par l'Agence de la biomédecine L’extension du dpi au typage HLA a eu lieu en apres la révision de la loi de bioethique. Cette extension permet le dpi avec typage hla et la realisation du diagnostic d’exclusion

22 Le DPI pour qui ?

23 Quelques maladies autosomiques récessives Mucoviscidose - Amyotrophie spinale - Drépanocytose - Bêta-thalassémie - Ataxie de Friedreich –Maladie de Tay-Sachs - Nanisme diastrophique - Polykystose rénale autosomique récessive - Epidermolyse Bulleuse

24 Quelques maladies autosomiques dominantes Dystrophie myotonique de Steinert – STB -Neurofibromatose - Maladie de Huntington - Achondroplasie - Atrophie optique dominante - Currarino - Charcot-Marie Tooth type 1A - Brachydactylie - Maladie de Hirschsprung - Maladie de von Hippel-Lindau - Néoplasie endocrinienne multiple - Ostéogénèse imparfaite - Rétinoblastome héréditaire -

25 Quelques maladies liées à l'X     Syndrome de l'X fragile - Myopathie de Duchenne et Becker - Hémophilie - Syndrome de Wiscott Aldrich - Syndrome de Lesch-Nyhan - Rétinite pigmentaire lié à l'X - Pelizaeus Merzbacher - Myopathie myotubulaire - Maladie de Fabry - Incontinentia pigmenti - Hydrocéphalie liée à l'X - Maladie de Hunter - Déficit en OTC -  

26 Quelques maladies mitochondriales NARP – MERF - MELAS

27 Diagnostic d’exclusion Huntington, CADASIL, …

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29 Les autres formes de DPI
DPI chromosomique PGS Sexing

30 DPI chromosomique Nombre de cycles en europe 2010

31 Aneuploïdie screening
Âge maternel avancé Avortements spontanés Fausses couches répétées

32 « Sexing »

33 CGH array Harper 2011

34 Le DPI/HLA dans le monde
Anémie de Fanconi drépanocytose Béta/alpha Thalassémie Syndrome Wiscott-Aldrich X-ALD Hyper IGM syndrome Dysplasie ectodermique hypohydrotique Syndrome d’Omen Ataxie télangiéctasie Granulomatose chronique Neutropénie congénitale sévère Le typage HLA apres Dpi est aujourdhui tres repandu dans le monde et a été effectue pour une douzaine de maladie génétique. Il existe aussi maintenant le Dpi avec typage HLA mais sans diagnostic génétique, pour des maladies acquises comme les leucemies mais celui-ci n’est pas autorisé en France.

35 Les demandes de DPI / HLA
Drépanocytose Béta-thalassémie Béta-thal/drépano Anémie de Fanconi Alpha thalassémie Autres (granulomatose septique chronique, Schwachman-Diamond) Les demandes de DPI / HLA

36 « preimplantation HLA typing »
Leucémies Blackfan Diamond Wiscott Aldrich

37 En 2010, cela fait vingt ans que le DPI existe et 50 000 cycles ont été effectués dans le monde. Les mille premières naissances ont été atteintes en On peut compter près de naissances. A peu près un quart des cycles de DPI effectués le sont pour des maladies monogéniques. Le taux de grossesse après DPI est de 22%.

38 Partie II Les étapes du DPI

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40 Stimulation ovarienne
Pour un DPI, il faut recueillir un maximum d’ovocytes afin d’obtenir le plus grand nombre d’embryons. On va donc stimuler les ovaires de la patiente a l’aide d’hormones afin que se développent plusieurs follicules. hormones ovaire

41 Agoniste Retard (DPI) Schéma thérapeutique Inhibition de l’hypophyse :
blocage de la fonction ovarienne Stimulation de la fonction ovarienne Décapeptyl 3,0 mg, IM ponction hCG ovulation biopsie transfert Env. 3 semaines Pendant les règles ou à J18-22 Traitement de stimulation Environ 12 jours Contrôles (prises de sang + échographies) 3-5 fois pendant cette période à Béclère

42 ovulation Ces foliculles vont produire un nombre important d’ovocytes ; ovocyte

43 Ponction ovocytaire ovocyte
les ovocytes sont récupérés sous echographie . ovocyte

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45 ICSI Les ovocytes sont ensuites fécondés avec les spz du conjoint. Un seul spz est injecté par ICSI. ovocyte

46 ICSI ovocyte

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49 Le clivage du zygote ovocyte
Apres l’icsi, nous attendons que l’embryon se divise pendant trois jours jusqu’au stade huit cellules ou blastomères. ovocyte

50 Le clivage du zygote 2 pronucléi
Apres l’icsi l’embryon va se diviser pendant trois jours jusqu’au stade huit cellules 2 pronucléi

51 Le clivage du zygote 2 blastomères 2 pronucléi
Apres l’icsi l’embryon va se diviser pendant trois jours jusqu’au stade huit cellules 2 blastomères 2 pronucléi

52 Le clivage du zygote 2 blastomères 4 blastomères 2 pronucléi
Apres l’icsi l’embryon va se diviser pendant trois jours jusqu’au stade huit cellules 2 blastomères 4 blastomères 2 pronucléi

53 Le clivage du zygote 2 blastomères 4 blastomères 8 blastomères 2
Apres l’icsi l’embryon va se diviser pendant trois jours jusqu’au stade huit cellules 2 blastomères 4 blastomères 8 blastomères 2 pronucléi

54 biopsie Au troisieme jours, l’embryon est prêt a etre biopsié. 8 blastomères

55 biopsie Laser 8 blastomères
La biopsie se fait en perçant la zoner pellucide a l’aide d’un laser. 8 blastomères

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57 biopsie Laser 8 blastomères
La biopsie se fait en perçant la zoner pellucide a l’aide d’un laser. 8 blastomères

58 biopsie 2 blastomères 8 blastomères
Deux blastomeres sont ainsi extrait de l’embryon sans que cela n’influence son développement futur. 2 blastomères 8 blastomères

59 Lyse des blastomères Les deux cellules sont places individuellement dans deux tubes contenant un tampon de lyse.

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62 Lyse des blastomères Les deux cellules sont places individuellement dans deux tubes contenant un tampon de lyse.

63 Extraction d’ADN L’adn est ainsi libéré de la cellule et peut être analysé.

64 Amplification pan-génomique
Multiple Displacement Amplification Vu la complexité de la PCR, et le nombre important de marqueur a etudier nous repliquons cet adn par une étape d’amplification pan genomique.

65 PCR Mutation Marqueurs HLA PCR
l’adn ainsi produit en grande quantité permet l’analyse de la mutation présente dans la famille, des marqueurs liés au locus morbide, ainsi que l’analyse du locus HLA

66 Détermination des embryons sains
Mutation Marqueurs HLA L’analyse directe en PCR permet de déterminer quels sont les embryons porteurs de la mutation.

67 Détermination des embryons sains
Mutation Marqueurs HLA + - + + - Les embryons non porteurs sont candidats au transfert

68 Détermination des embryons sains
Mutation Marqueurs HLA + - + + - L’analyse indirecte permet de confirmer le diagnostic en comparant les haplotypes des embryons a ceux de l’enfant atteint.

69 Détermination des embryons sains
Mutation Marqueurs HLA + - + + - + - + + -

70 Détermination des embryons compatibles
Mutation Marqueurs HLA + - + + - + - + + - De la même facon, les haplotypes au locus HLA des embryons seront comparés a l’enfant atteint pour determiner cette fois ci ceux qui ont reçu les memes chromosomes.

71 Détermination des embryons compatibles
Mutation Marqueurs HLA + - + + - + - + + - + - - - -

72 Détermination des embryons compatibles
Mutation Marqueurs HLA + - + + - + - + + - Les embryons haploidentiques et exempt de la maladie seront selectionnés pour etre transférés. + - - - -

73 Transfert des embryons
Apres le diag les embryons sains sont re-implantés le jour même ou le lendemain.

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75 Grossesse La grossesse est surveillée jusqu a la naissance

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77 Naissance La grossesse est surveillée jusqu a la naissance

78 Naissance La grossesse est surveillée jusqu a la naissance

79 Greffe A la naissance, les cellules souches hematopoietiques du cordon ombilical du nouveau né sont prelevées et peuvent être utilisées comme traitement pour l’enfant atteint.

80 guérison

81 Embryons HLA compatible 16-17% et non atteint (11% contre 18% attendu)
Résultats Embryons HLA compatible 16-17% (25% attendu) et non atteint (11% contre 18% attendu)   Take home baby rate = 9%

82 LE DIAGNOSTIC MOLECULAIRE
Partie II LE DIAGNOSTIC MOLECULAIRE Analyse génétique d’un embryon âgé de trois jours

83 La PCR

84 Science, like nothing else among the institutions of mankind, grows like a weed every year. Art is subject to arbitrary fashion, religion is inwardly focused and driven only to sustain itself, law shuttles between freeing us and enslaving us.

85 La PCR

86 La PCR

87 Le gel d’agarose Le séquenceur
Méthodes d’analyse Le gel d’agarose Le séquenceur

88 Méthodes d’analyse Les fragments d’ADN sont chargés négativement. Placés dans un champ électrique, ils vont se déplacer de la cathode vers l’anode. Plus les fragments sont petits, plus ils vont migrer rapidement.

89 Les difficultés du DPI Le peu de matériel biologique disponible DPN
Analyse Génétique Analyse génétique 1-2 cellules/embryon Extraction d ’ADN 10 Millions de cellules

90 Les difficultés du DPI Le peu de temps pour le diagnostic DPN DPI
Rendu des résultats en une semaine Rendu des résultats en 24h pour transfert à J4

91 Les difficultés du DPI Les risques de contamination Cellules du
manipulateur Spermatozoïde Cellules de la mère Fragment d’ADN (amplification précédente)

92 Les difficultés du DPI La qualité des embryons Pas de diagnostic
Absence de noyau CM CN Noyau en dégénérescence / mauvaise morphologie Pas de diagnostic

93 Les difficultés du DPI allele drop out

94 Détermination des embryons compatibles
Mutation Marqueurs HLA + - + + - + - + + - Les embryons haploidentiques et exempt de la maladie seront selectionnés pour etre transférés. + - - - -

95 deux méthodes alternatives utilisées : Analyse directe :
DPI - Stratégies deux méthodes alternatives utilisées : Analyse directe : détection de la MUTATION Analyse indirecte : utilisation de MARQUEURS polymorphes Le development des techniques de dpi a offert la possibilité de choisir des enfants sains En général, deux méthodes sont utilisées pour ce diagnostic. Le methode directe basee sur la detection de l’allèle sain et indirectes qui utilise l’analyse de marqueurs polymorphes.

96 L’analyse préalable

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102 LA REGION HLA Chromosome 6 La région HLA se situe sur le chromosome 6.

103 LA REGION HLA 6 p 21 Elle est située plus exactement sur le bras court, en 6 P21

104 LA REGION HLA Class I Class II
HLA-A Class I HLA-C HLA-B HLA-DR Class II HLA-DQ HLA-DP La région HLA contient une batterie de gènes codant pour des protéines de classe I et II. Ces proteines ont un rôle dans la reconnaissance antigénique. Ces molécules ont également un rôle allogénique et sont responsables des rejets de greffons non compatibles.

105 LA REGION HLA Class I Class II
D6S276 D6S1624 HLA-A D6S510 Class I HLA-C D6S2972 D6S265 HLA-B D6S273 D6S1615 HLA-DR Class II D6S1666 HLA-DQ D6S2876 HLA-DP D6S2874 D6S2749 Nous avons choisi des marqueurs polymorphes couvrant entièrement la région HLA , de la région la plus télomérique à la plus centromerique. D6S1618 D6S1560 D6S439 D6S1610 D6S426

106 Le « génotypage » HLA A B C D B D B D A D A C B C 1/4

107 La drépanocytose A S A S S S S S A S S A A A 3/4

108 TYPAGE HLA ET DREPANOCYTOSE
1 2 3 4 2 4 1 4 1 3 2 3 HLA 1/4 A B C D B D B D A D B C A C 3/4 3/16

109 DPI et HLA dossiers agence (2010)
19 dossiers constitués 15 drépanocytose 4 béta-thalassémie 2 dossiers incomplets 17 dossiers autorisés 11 couples 15 stim débutés 59 embryons 4 grossesses spontanées 7 transferts 3 enfants , 1 compatible 4 non compatibles 3 compatibles

110 QUESTIONS ETHIQUES

111 Risque d’instrumentalisation de la vie de cet enfant .

112 Risque que l’enfant décède avant la naissance du bébé compatible Risque que la greffe échoue Risque de négligence pour les frères et sœurs

113 Alternatives thérapeutiques : pas encore fiables (banques de donneurs) Les embryons sains non HLA compatibles? la loi interdit un 2ème DPI tant qu’il reste des embryons sains transférables Risque de dérives ? : la Loi française qui encadre le DPI est très stricte

114 Augmenter les possibilités ne force personne
à effectuer un choix qui heurte sa morale . M. Onfray

115 LA FAMA NECKER – BECLERE
Biologie de la reproduction R. Frydman N . Frydman L.Hesters A.Benachi G.Tachdjian Hôpital Génétique moléculaire P. Burlet N. Gigarel J. Steffann A. Munnich Cytogénétique M. Le Lorc’h S. Romana M. Vekemans Hôpital Necker I would like to thank my team from paris thank you for your attention Antoine-Béclère


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