Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila

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1 Genetic Suppression of Polyglutamine Toxicity in Drosophila
Parsa Kasemi-Esfarjani, et al ; Science 287, 1837 (2000) Aurel

2 Visée de l’article Aurel Introduction

3 Introduction Chorée de Huntington : Agrégats de polyglutamine au niveau du SNC Utilisation de drosophiles présentant ce phénotype comme modèle de la maladie Criblage des gènes suppresseurs de ce phénotype Homologie des protéines entre la drosophile et l’humain Aurel : La chorée de Huntington, comme d’autres (maladie de Parkinson), est caractérisée notamment par des anomalies cellulaires : des agrégats (cytosoliques et /ou nucléaires) de polyglutamines. Ceux-ci causent une toxicité engendrant une mort cellulaire. Il est donc intéressant d’utiliser cette caractéristique comme modèle pour la maladie d’Huntington. On crée donc des drosophiles transgéniques présentant un phénotype du type de cette maladie : par mutagénèse dirigée, on introduit dans le génome des séquences polyCAG, qui codent donc pour des polyglutamines. A partir de ces souches mutantes, on peut alors chercher des gènes suppresseurs, par croisement avec d’autres souches possédant des fragments de génome particuliers et supprimer les phénotypes mutants. Ici on en utilise 2 différents dont l’expression donne des protéines, dHDJ1 et dTRP2, qui rétablissent en partie le phénotype sauvage dans les lignées transgéniques présentant des agrégats de polyglutamines. DHDJ1 est un homologue de la protéine de choc thermique humaine 40/hDJ1, et dtRP2 est un homologue de la protéine répétée tétratricopeptide humaine.

4 Description de la méthode
Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln Aurel : Avant de supprimer les phénotypes, ils faut d’abord les obtenir et donc créer des mouches présentant le phénotype recherché, à un endroit particulier : l’œil, qui permet chez la drosophile une observation rapide, pratique et représentative car les ommatidies sont composés de neurones, les mêmes cellules qui sont touchées chez l’homme dans le cas de la maladie de H. Description de la méthode

5 Description et élaboration des lignées transgéniques poly-Gln
Lignées comportant des polyCAG 20 répétitions : lignée 20Q (normales) 127 répétitions : lignée 127Q (augmentées) Après traduction des ARNm, obtention de polyglutamines de ces 2 types Utilisation de différents promoteurs pour induire l’expression génique spécifiquement dans les yeux Aurel

6 Rappel : Mutagénèse par élément P
Pied P w+ Site de clonage Origine de réplication AmpiR Transposase Plasmide avec Elément P Source de Transposase Jean : On élabore un plasmide, contenant la séquence d’intérêt (inséré au niveau d’un multi-site de clonage) entourée par les pieds P (contient également le gène miniwhite, qui engendre un phénotype rouge dominant au niveau des yeux) Le plasmide contient également un gène de sélection (en dehors de la partie que l’on souhaite intégrer), qui sert à la sélection lors de l’amplification du plasmide. On l’injecte dans l’embryon (lignée white (œil blanc)), avant la cellularisation (plein de mitoses successives sans séparation), pour que toutes les cellules présentent le plasmide, avec une source de transposase, ce qui permet la recombinaison du plasmide au niveau du génome de la drosophile. L’élément d’intérêt est alors intégré au génome. Le gène miniwhite va permettre de sélectionner les mouches qui présentent l’élément P inséré dans le génome. On pourra ensuite multiplier les mouches par croisement avec des mouches whites – (œil blanc) On crée des lignées de mouches transgéniques présentant les caractères qui nous intéressent. On ne sait pas vraiment s’ils ont utilisé cette méthode A P w- Embryon de drosophile

7 Rappel : Mutagénèse par élément P
Injection avant cellularisation : pour injection dans le cytoplasme de toutes les cellules. Injection dans embryon de mouches sauvages pour White, normalement blanches : Les mouches avec un phénotype rouge (dû à miniwhite) au niveau des yeux sont alors sélectionnées (témoins de l’insertion de l’élément P dans le génome) Jean :

8 Élaboration préalable de 2 lignées transgéniques
Jean : Que l’on va croiser par la suite pour obtenir la lignée exprimant les polyglutamines dans les yeux.

9 Lignée UAS-polyCAG Insertion d’un élément P contenant : Promoteur UAS
Séquence polyCAG (20 ou 127 répétitions) Séquence codant pour un épitope de l’hémagglutinine (HA) Jean : Par PCR, on synthétise des polyCAG de différents types : Les normaux font 20 répétitions nucléotidiques (ce sont les témoins, chez l’homme les cas non pathologiques présentant des répétitions de 20 CAG), puis les augmentés font 127 répétitions nucléotidiques. Ce polyCAG est placé en aval d’un promoteur UAS dans un plasmide transposable (élément P), ensuite utilisé pour créer une lignée transgénique de drosophiles. Le promoteur UAS est inductible par la protéine GAL4. On place sur la construction, une séquence codant pour un épitope de l’hémagglutinine (noté HA), de façon a ce que cette séquence soit transcrite avec le polyCAG, puis traduite par la suite en épitope. On s’en servira pour un marquage des polyglutamines. On nomme cette construction UAS-polyCAG_HA. Figure : construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

10 Lignée GMR-Gal4 Insertion d’un élément P contenant :
Promoteur GMR (expression au niveau des yeux) Séquence GAL4 codant pour la protéine GAL4 Jean : On crée une seconde lignée transgénique comportant une séquence GAL4 (cDNA du gène GAL4) placée en aval d’un promoteur GMR. Le promoteur GMR est une structure promotrice permettant une expression uniquement dans l’œil. Le promoteur est activé par une protéine spécifique des disques imaginaux des yeux, jouant alors le rôle de facteur de transcription au niveau du futur œil. Figure : Construction génomique incorporée dans le génome de la drosophile

11 Croisement des 2 lignées
Croisement et 3 lignées 20Q et de 3 lignées 127Q par la GMR-GAL4 (fond génétique) Obtention de drosophiles exprimant les polyglutamines dans l’œil. Elles sont UAS-polyCAG et GMR-GAL4 Jean : Pour éliminer les biais dus au fond génétique, on sélectionne plusieurs lignées de chaque type. On voit alors si l’endroit de l’insertion joue un rôle sur le phénotype. Par exemple, si ça s’insère en plein milieu d’un gène, dans une région codante, on aura une activation qui conduira à un phénotype particulier, ceci pour chaque différent locus d’insertion. Si ça s’insert dans une région non codante, on n’aura pas de problème quant à l’expression normale des génotypes.

12 Polyglutamine avec épitope HA
5’ 3’ Poly CAG UAS HA GAL 4 GMR Facteur de transcription spécifique de l’œil Transcription de GAL4 Protéine Gal4 ARNm Gal4 Traduction de l’ARNm Gal4 Induction de la transcription ARNm Transcription Traduction Polyglutamine avec épitope HA Jean :

13 Elaboration des lignées transgéniques poly-Gln
Aurel : Résultats

14 Phénotypes obtenus après croisement
Lignées 20Q : [sauvage] Lignées 127Q : [agrégation de polyglutamines] Utilisation des lignées 127 Q pour trouver les gènes suppresseurs. Aurel : On a croisé avec DMR-GAL4 les lignées : Lignée 20Q : phénotype sauvage, ça montre que la répétition de 20 triplets ne cause pas d’agrégation comme ce qui est retrouvé dans le cas d’un homme non malade. Lignée 127Q : on les utilise pour trouver les gènes suppresseurs. C’est sur ces lignées que l’on fera nos études.

15 Description de la méthode
Criblage et mise en évidence des gènes suppresseurs Aurel : Description de la méthode

16 Création des lignées transgéniques à testée
7000 éléments P différents (contenant 7000 séquences autosomales différentes) Mutagénèse utilisant ces éléments P : obtention de 7000 lignées transgéniques différentes. Croisement avec les lignées 127 Q Aurel : On crée des lignées transgéniques par insertion d’éléments P, dans les cellules germinales (voir protocole mutagénèse avec élément P), que l’on croise avec les individus des lignées possédant un phénotype type Huntington (agrégats de polyglutamine) séquences autosomales sont insérées dans des éléments P, que l’on utilise pour la création des lignées transgéniques.

17 Criblage et mise en évidence des gènes suppresseurs
Jean : Résultats

18 Lignées intéressantes
Sur les 7000 lignées croisées avec les drosophiles présentant la dégénérescence, on trouve : 29 lignées « Enhancer » 30 lignées « Suppresseur » On retient Deux lignées Suppresseurs : EU 3500 et EU 3220 Jean : Seulement quelques lignées engendrées par ce croisement sont intéressantes. Deux principaux types se démarquent : on a observé 29 lignées qui perfectionnaient la dégénérescence, et 30 qui tendaient à retrouver un phénotype sauvage. Dans cet article nous sont rapportés les résultats pour les deux premières lignées pour lesquelles les effets de suppression ont été directement confirmés : Lignée EU3500 et lignée EU3220.

19 Techniques d’observation
Aurel: Techniques d’observation

20 Mise en évidence des différents phénotypes
Aspect extérieur : microscopie optique, et MEB Immunohistologie et observation microscopique : DAPI et FITC Aurel :

21 Microscopie photonique
Aurel : On observe simplement les yeux de drosophile au microscope photonique, on peut alors apprécier l’intensité de coloration des pigments rouge. Cette coloration est telle car la drosophile exprime le gène W+, de phénotype rouge, sauvage.

22 Microscopie électronique à balayages
Aurel : Grâce au MEB, on apprécie la forme de l’œil, en complément de la microscopie photonique On observe les yeux par microscopie électronique à balayage après avoir utilisé des techniques de fixation adaptées.

23 FITC (Fluorescein isothiocyanate)
Aurel : Anticorps secondaire flanqué de l’FITC L’épitope HA pourra être reconnu par des anticorps dirigé contre l’hémagglutinine : on réalisera donc un immunomarquage de coupes histologiques d’œil, utilisant des anticorps primaires anti-HA, puis des anticorps secondaires fluorescents, pour mettre en évidence la présence ou non d’amas de polyglutamines. Les anticorps secondaires utilisés sont flanqués par FITC (Fluorescein isothiocyanate). La fluorescéine absorbe les radiations bleues (max 490nm) et restitue une fluorescence verte (max 520nm).

24 DAPI (Di aminido phényl indol)
Aurel : DAPI : marquage des noyaux On réalise également un immunomarquage DAPI (Di aminido phényl indol) qui permet un marquage non spécifique de tous les noyaux. On peut alors localiser les corps cellulaires sur les coupes. Eclairé en lumière violette (max 372nm), il émet une fluorescence bleue (max 456nm).

25 Résultats Jean : La colonne A constitue le contrôle négatif : on utilise la lignée GMR-Gal4, aussi pour montrer que l’insertion de la séquence (GMR-Gal4) n’influe pas sur le phénotype, et surtout parce que GRM-Gal4 est présent dans toutes les lignées. La colonne B constitue le contrôle positif : elle présente le phénotype des lignées GMR-Gal4 associé à UAS-127Q. On voit très nettement une malformation de l’œil (mise en évidence par toutes les méthodes d’observation, comparées au contrôle négatif), une absence de pigmentation et des agrégats de polyglutamines, mis en évidence par FITC et DAPI. L’effet recherché par l’utilisation des suppresseurs est de repasser du phénotype B au phénotype A.

26 Aurel : La colonne C présente le résultats du croisement d’une mouche de phénotype correspondant à la colonne B (huntington) croisé avec une mouche portant l’élément P EU3500. On constate que l’on restaure ainsi la structure externe et la pigmentation de l’œil. On met donc en évidence un gène suppresseur. Cependant, les polyglutamines sont toujours présents. La colonne D présente le résultats du croisement d’une mouche de phénotype correspondant à la colonne B , avec l’ADNc UAS-dhdJ1, c'est-à-dire seulement la partie en 3’ de l’élément P EU3500. On note ici que la structure externe de l’œil est en grande partie rétablie, mais on observe toujours, comme dans la colonne C, des agrégats de polyglutamines. On réduit donc l’effet suppresseur au gène codant pour dhdJ1, présent en 3’ de l’élément P EU3500, homologue à l’HSP40. La structure externe est mieux rétablie, il n’y a plus de noyaux dans la partie interne de la rétine, notamment visible grâce au DAPI qui montre que les noyaux restent en grande partie dans la zone périphérique. Cependant, le FITC montre que des agrégats demeurent dans l’ensemble.

27 Lignée EU3500 Code pour HDJ1 (en 3’ de EU3500) : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain Domaine J en NH2 terminal (jonction) Aurel :

28 Aurel : Lignée EU3500 : Code pour HDJ1 : protéine homologue de la protéine HSP40/HDJ1 chez l’humain Domaine J en NH2 terminal (jonction) Domaine J souligné

29 Jean: La colonne E présente le résultats du croisement d’une mouche de phénotype correspondant à la colonne B, avec l’élément suppresseur P EU3200. On a encore amélioration de la structure générale de l’œil, mais la taille de l’œil n’est pas totalement rétablie. DAPI et FITC montrent une amélioration de la structure interne de la rétine, avec des dégénérescences rétiniennes. La colonne F présente le résultats du croisement d’une mouche de phénotype correspondant à la colonne B , avec cette fois-ci l’ADNc UAS-dtpr2, correspondant à la partie 3’ du gène de l’élément suppresseur P EU3220. On montre que cette partie de l’élément P suffit à supprimer en partie la dégénérescence de l’œil.

30 Lignée EU3220 Code pour DTPR2 (en 3’ de EU3220) : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2) Domaine J en COOH terminal Jean :

31 Jean : Lignée EU3220 : Code pour DTPR2 : protéine homologue de la protéine répétée TRP2 humaine (tétratricopeptide 2) Domaine J en COOH terminal

32 Jean : Discussion

33 Implication du domaine J
Responsable la suppression Domaine présent sur les HSP Etudes complémentaires in vitro : domaine J supprime les agrégations par fixation des protéines agrégées Ici dHdj1 ou dtpr2 se lieraient donc aux polyglutamines pour les empêcher de former des agrégats Jean : C’est apparemment le domaine J qui est responsable de la suppression du phénotype dégénérescent. Ce domaine présent notamment sur les protéines de choc thermique, telles que HsP70, semble inhiber les agrégations, ceci a été montré dans des expériences in vitro complémentaires. Le domaine J fixe des protéines, notamment ici les polyglutamines, ce qui empêche les agrégations. Ce que l’on voit par fluorescence grâce à l’FITC après suppression ne serait peut-être pas des agrégats, mais les polyglutamines liées à dHDJ1 ou à dtpr2, selon les lignées.

34 Aurel : Conclusion

35 Gènes suppresseurs déterminés
Croisement de mouches présentant un phénotype à supprimer, par des mouches possédant chacune un élément P différent Détermination des descendants présentant un phénotype supprimé On peut déterminer quel gène est impliqué dans la suppression du phénotype mutant Aurel : L’important dans cet article, c’est que par un criblage génique, on peut trouver des gènes suppresseurs ou enhancers (ici des suppresseurs). Ce qu’il faut retenir, c’est l’utilisation de drosophiles transgéniques présentant un phénotype de type Huntington (avec des agrégats de polyglutamines), que l’on croise par des drosophiles également transgéniques, portant des éléments P insérés dans leur génome. Après les croisements, on détermine lesquels modifient le phénotype, et on peut alors conclure sur l’action des éléments P insérés. Connaissant la séquence de chaque élément P, on saura quels gènes sont impliqués dans les suppressions.

36 Vers un traitement? Agrégats de polyglutamine = gain de fonction
On ne peut pas insérer un gène pour le traiter : thérapie génique impossible On pourrait tenter de surexprimer un gène pour supprimer le phénotype. Problème : pléiotropie Difficile Jean : Ce genre de technique peut être aussi utilisé dans d’autres types de maladies présentant des agrégations, comme par exemple la maladie de Parkinson. Grâce à ce type de modèle animal, on peut par homologie mieux comprendre le mécanisme de cette maladie, et peut-être trouver un moyen de la traiter. Faire de la thérapie génique dans ce cas n’est cependant pas possible. C’est une maladie à gain de fonction, et non à perte de fonction, et il ne suffit pas d’insérer le bon gène pour la traiter. On peut tenter de surexprimer un gène pour supprimer le phénotype, comme ici des une protéines de type HSP qui contiennent un domaine J qui va éviter les agrégations. Notre problème est l’interaction du gène sur plusieurs caractères. Cependant, il est possible grâce à ces résultats de trouver des pistes de recherche.

37 The end