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CICUREL Caroline 3 e 3. Présentation de lentreprise Fonctionnement de lentreprise Observation et présentation dune activité Compte-rendu hebdomadaire.

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1 CICUREL Caroline 3 e 3

2 Présentation de lentreprise Fonctionnement de lentreprise Observation et présentation dune activité Compte-rendu hebdomadaire Description des tâches accomplies Conclusion

3 LInstitut National de la Recherche Agronomique (INRA), créé en 1946, est un organisme placé sous la double tutelle du ministère de lEnseignement supérieur et de la Recherche et du ministère de lAgriculture et de la Pêche. Cet organisme mène des recherches finalisées pour une alimentation saine et de qualité, pour une agriculture compétitive et durable, pour un environnement préservé et valorisé. Les trois thématiques de recherches du centre de lINRA de Dijon sont: Goût, alimentation et sensorialités : Unité Centre des Sciences du Goût et de lAlimentation (CSGA) Agroécologie de la parcelle cultivée Territoire et développement LINRA de Dijon est composé de 200 chercheurs répartis dans 12 unités. Un des bâtiments de lINRA. Le logo de lentreprise DIJON L INRA de Dijon

4 Direction Collège de direction Equipes de recherche Plates formes Services communs Interactions moléculaires, destruction en bouche et perception de la flaveur Perception de la flaveur : évènements peri-récepteurs et interactions perceptives Mécanismes de perception et plasticité chimiosensorielle chez la Drosophile Développement des neurones olfactifs Détection cérébrale des nutriments Œil, nutrition et signalisation cellulaire Ethologie développementale et psychologie cognitive Développement et dynamique des préférences et du comportement alimentaires Culture, expertise et perception Animalerie PFLA (Plate Forme Lipide-Arômes) PFSENSO (Plate Forme Sensorielle) _ Secrétariat _ Documentation _ Informatique, traitement signal _ Logistique _ Secrétariat _ Documentation _ Informatique, traitement signal _ Logistique

5 Marquage par la Filipine du cholestérol estérifié sur une coupe dœil de souris. 1) Extraction de lœil Jai accompagné Emilie, une chercheuse de lINRA, à lanimalerie pour chercher deux souris à sacrifier. Après les avoir endormies et nous être assurées de leur mort, nous leur avons extrait les yeux en leur coupant la paupière à laide de ciseaux. Ensuite, nous avons sectionné le nerf optique des souris jusquà ce que lœil ne soit plus du tout rattaché au corps de la souris. Nous avons ensuite mis lœil dans du milieu et lavons observé au microscope. A laide de celui-ci, nous avons enlevé la cornée en utilisant deux pinces. Nous avons ensuite mis les yeux dans de lOCT.nerf optique milieucornéeOCT 2) Congélation de lœil Nous avons placé lœil, le nerf optique vers le haut, dans une petite capsule dans laquelle on a versé de lOCT pour le conserver. Puis, on a placé la petite capsule dans un congélateur à -20 °C pour que lOCT durcisse. 3) Réalisation dune coupe dœil à laide dun cryostat. Nous avons pris dans le congélateur une petite capsule comportant un œil. Nous lavons sorti de la petite capsule (avec lOCT) et lavons fixé sur un cryostat à laide dun peu dOCT qui a durci et la bien fixé. La température interne du cryostat est de -20°C environ. En appuyant sur une pédale, un mécanisme abaisse lœil qui passe sur une lame tranchante immobile et réalise une coupe de 10 microns dépaisseur. Nous avons effectué cette manipulation jusquà ce que lœil soit entièrement découpé. On a placé les coupes dœil sur des lames. Il faut environ 15 lames pour collecter toutes les coupes dun seul œil.cryostat images

6 4 ) Elimination du cholestérol estérifié Nous avons pris les lames sur lesquelles apparaissent le nerf optique et les avons placées dans un récipient contenant de léthanol à 70% qui élimine le cholestérol libre. Après environ cinq minutes, nous avons remplacé léthanol par du PBS (eau salée). Nous avons une nouvelle fois laissé incuber environ cinq minutes.éthanol 5)Préparation de la Filipine. Pendant les incubations avec léthanol et le PBS, nous avons pesé la filipine avec une balance extrêmement précise (à la précision de 0,1mg). Avant la pesée, il a fallu sassurer que la balance était conforme à laide de poids que lon a pesés : les résultats sont vérifiés en les comparant avec les valeurs que lon doit obtenir, inscrites sur une fiche. Cette vérification effectuée, nous avons mis la quantité voulue de filipine dans un petit tube dans lequel nous avons ensuite ajouté du PBS. Nous lavons légèrement secoué pour dissoudre la poudre.filipine 6)Répartition de la solution de filipine sur les lames contenant les coupes doeil. Nous nous sommes rendues dans les salles de culture. Nous avons aligné les lames sur un support et nous avons dessiné un rectangle faisant le tour de chaque lame avec un stylo « Dako Pen ». A laide dune pipette, nous avons déposé la solution de filipine, sans que celle-ci ne déborde. La filipine permet de visualiser le cholestérol estérifié sous un microscope car cest une molécule fluorescente.Dako Pen cholestérol estérifié images

7 LundiMardiMercrediJeudiVendredi Matin 9h30-12h30 Animalerie Salle chirurgicale Observation des yeux de rats endormis qui ont subi des impacts laser au niveau de la rétine afin de simuler une maladie de lœil, avec les chercheurs. 9h00-12h30 Remise de documents par mon maître de stage. Découpe dœil à 10 microns grâce à un cryostat avec une chercheuse du laboratoire. 9h00-10h00 Animalerie Observation dune maquette de lanimalerie. Découpe de la nourriture pour les rats. Malade (certificat médical) 9h00-11h30 Animalerie Gavage des rats. Sacrifice de rats (autre salle). Découpe dœil au cryostat. 11h30-12h30 Marquage du cholestérol estérifié par la Filipine. Salle de culture Observation au microscope dyeux extraits lundi. 9h00-13h30 Dosage de la lutéine dans des prélèvements de sang de sept cochons différents. Après-midi 13h30-17h00 Animalerie Salle chirurgicale Nettoyage de la salle et retour des derniers rats dans leur cage et dans leurs salles appropriées. Sacrifice de deux souris. Extraction de leurs yeux, observation au microscope, explications et schéma par une chercheuse du laboratoire. Observation au microscope dune cellule. 13h30-14h30 Poursuite de la coupe de lœil. 14h30-16h15 Salle de réunion Présentation de son parcours par une personne qui intègre léquipe devant ses futurs collègues. 16h15-17h30 Salle de culture Changement du milieu de lœil extrait la veille. Malade (certificat médical) 13h00-18h00 Découpe dœil au cryostat. Réunion au sujet de la salle de culture (améliorations à apporter …) Découpe dœil au cryostat. Salle dobservation Observation au microscope du cholestérol sur des coupes dyeux de souris. 14h30-16h30 Dosage de la lutéine dans des prélèvements de sang de sept cochons différents.

8 Lobservation de la rétine dune vingtaine de rats. Trois semaines auparavant, les chercheurs avaient simulé une maladie de lœil en faisant des impacts au laser au niveau de la rétine des yeux des rats. Nous nous sommes rendus à lanimalerie et avons observé les dommages au niveau de la rétine. Pour cela, les chercheurs ont pris les rats un par un, les ont endormis à laide dun mélange danesthésiques, ont appliqué de la tropicanide sur leurs yeux afin de dilater la pupille et ont placé les rats endormis devant un angiographe. Nous avons observé devant un écran dordinateur la rétine et les impacts laser. Le but de cette opération est de chercher à connaître les liens entre lalimentation et les pathologies de lœil, et donc grâce à lalimentation, de prévenir les maladies de lœil.angiographe Le changement dun milieu. Pour changer un milieu, il faut dabord stériliser un plan de travail en utilisant de lalcool. Nous avons ensuite allumé une hotte stérile et y avons placé létui contenant le milieu et les cellules. Jai ensuite pris une pipette qui aspire automatiquement le milieu. Jai pris une seconde pipette, appuyé sur le bouton qui aspire, trempé celle-ci dans un nouveau milieu, puis jai expiré ce milieu dans létui de cellules. Jai effectué cette manipulation deux fois, la première servant à rincer létui. Le gavage. Avant de gaver les rats, il faut dabord les peser en les déposant dans un bac placé sur une balance. Cest le poids du rat qui va déterminer la dose de nourriture que lon va lui administrer. Après lavoir pesé, on a pris le rat et on lui a injecté la nourriture dans sa bouche. Une fois gavé, le rat est déposé dans sa cage sur laquelle des numéros sont inscrits. Les rats et les souris sont tous porteurs dune puce que lon lit à laide dun lecteur de puce. Cest grâce à cela que lon sait dans quelle cage reposer le rat. Lobservation au microscope dune lame de rétine de souris contenant du cholestérol. Lexpérience vise à étudier les effets de lexposition des souris sauvages aux facteurs de risque de la DMLA. Pour chaque souche de souris, les chercheurs ont constitué trois lots avec un traitement différent. Les deux premiers groupes ont subi une injection quotidienne dun sérum physiologique: ce sont les souris contrôle. Les deux groupes suivants ont subi une injection puis ont été exposés à la lumière. Les deux derniers ont subi une injection qui affaiblit leur système immunitaire puis ont été exposés à la lumière. Nous avons observé au microscope la rétine de lœil de lun de ces rats. Schéma explicatifDMLASchéma explicatif Le dosage de la lutéine.lutéine Jai accompagné une chercheuse dans une salle sans fenêtre. Nous avons travaillé sous une lumière jaune. Nous avons pris des fioles dans lesquelles se trouvent des prélèvements faits sur trois cochons différents. Il y a neuf prélèvements par cochon et il y a environ quatre fioles par prélèvement. On prend ces quatre fioles dans une main, puis on pool. On jette ensuite les trois fioles vides devenues inutiles. Pour finir, on aspire le prélèvement de la dernière fiole pour lexpirer dans une plus grande fiole. On fait cette manipulation sur tous les prélèvements des autres cochons.pool vidéo images

9 Ce stage ma permis de découvrir un univers professionnel que je ne connaissais pas, celui de la recherche en laboratoire. Jai constaté que lon pouvait exercer des métiers passionnants et variés. Jai apprécié laccueil que jai reçu, lambiance de travail et les activités que jai pu observer. Je me suis rendue compte que les connaissances acquises dans le cadre scolaire pouvaient être très utiles. Ce stage ma amenée à réfléchir sur lorientation de mes futures études. Je trouve cette expérience très enrichissante et je conseillerais à dautres élèves deffectuer ce type de stage en prenant soin dêtre très attentifs et de noter tous les soirs leurs activités de la journée. Je regrette toutefois que lon nait pas pu me confier certaines tâches car les expérimentations animales nécessitent une habilitation donnée par le ministère, et les manipulations présentent des risques biologiques et chimiques. Enfin, jai trouvé que la durée de ce stage était très courte.

10 Annexe des diapositives 7 et 8. Pour voir la VIDEO de la coupe dœil avec un cryostat, cliquez ici. Deux souris endormies Quelques yeux dans du milieu Microscope Petites pinces Yeux et milieu dans une capsule de verre Lœil dans lOCT Le cryostat Lœil Lame coupante Coupes Dessin dune cellule Lames Verre de PBS contenant les lames Feuille dexplications des étapes du marquage du cholestérol par la filipine Etalage de la solution de filipine et du PBS sur les lames qui contiennent le nerf optique Pour voir la VIDEO du dosage de la lutéine, cliquez ici. Schéma explicatif de lexpérience quont subi les rats Microscope permettant dobserver les milieux Le plan de travail devant lequel on change un milieu Observation au microscope dune rétine de souris

11 Angiographe : machine permettant dobserver très précisément lintérieur de lœil jusquà la rétine. Cholestérol estérifié : le cholestérol estérifié est, contrairement au cholestérol libre, est rattaché à la cellule par la membrane plasmique. Dessin dune celluleDessin dune cellule Cornée : membrane bombée située devant lœil. Elle est transparente. Elle se trouve sous la membrane conjonctive, une fine membrane protectrice. La cornée permet aux rayons lumineux de pénétrer dans lœil et les réfléchit ou les réfracte. Liris est situé juste derrière la cornée. Cryostat : appareil qui permet de maintenir des températures très basses et constantes grâce à lutilisation dun gaz liquéfié. Cette température permet ensuite deffectuer des coupes dyeux très fines. Dako Pen : stylo qui nous a permis dempêcher la filipine de déborder lorsquon la versée à laide dune pipette sur la lame. DMLA : elle désigne la Dégénérescence Maculaire Liée à lAge. La DMLA correspond à la mort des neurones de la macula, qui est une légère fossette située au centre de la rétine. Ethanol : liquide incolore, appelé aussi alcool éthylique, miscible à leau en toutes proportions. Filipine : poudre jaune qui permet de visualiser le cholestérol. Lutéine : la lutéine est un caroténoïde que lon trouve par exemple dans le jaune dœuf, le maïs ou les carottes. Elle est utilisée comme antioxydant pour protéger les organismes vivants. Milieu : liquide de couleur rose dans lequel on a placé les yeux disséqués afin de bien les conserver. Régulièrement, il faut changer le milieu pour éviter le développement de microbes. Nerf optique : nerf prenant naissance sur la rétine, qui est la membrane qui tapisse la face interne de lœil et qui contient les cellules permettant aux rayons lumineux dêtre captés, puis transformés en influx nerveux pour gagner le cerveau. OCT : lOptical Cohérence Tomography est un liquide pâteux transparent qui, en se refroidissant, devient dur et blanc. Il a conservé les yeux que nous avons congelés. Pooler : regrouper dans la même fiole. OCT œil Coupe réalisée, de 10 microns Dako Pen lames milieu yeux Schéma de loeil Cryostat


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