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Sécrétion des facteurs de virulence chez les bactéries A GRAM négatiF Responsable datelier: BLEVES Sophie Présentation de: ABBES Imen M2 Recherche Microbiologie.

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1 Sécrétion des facteurs de virulence chez les bactéries A GRAM négatiF Responsable datelier: BLEVES Sophie Présentation de: ABBES Imen M2 Recherche Microbiologie Novembre 2011

2 Deciphering the assembly of the Yersinia type III secretion injectisome Andreas Diepold, Marlise Amstutz, So¨ ren Abel, Isabel Sorg, Urs Jenal and Guy R Cornelis* The EMBO Journal (2010) 29, 1928–1940 | & 2010 European Molecular Biology Organization | All Rights Reserved /10

3 système de sécrétion de type III (T3SS) Modèle du système de sécrétion de type III chez P.aeruginosa (Thoma & Finlay, 2003) Injectisome : véritable seringue moléculaire Injection directe des protéines effectrices au travers de la membrane des cellules eucaryotes. Joue un rôle clé dans le processus infectieux dun certain nombre dagents pathogènes à Gram- (Yersinia, Salmonella, Eschirchia) Différentes familles dinjectisomes mais model structurale est très conservé

4 Yersinia enterocolitica Chez lhomme, est principalement responsable de gastro-entérites fébriles Appartient à la famille des Enterobacteriaceae Bacille à Gram négatif Non capsulé L'expression des caractères phénotypiques dépend de la température

5 T3SS de Yersinia enterocolitica Formation dYsc température de 37°C Effecteurs (Yop) Large répertoire d'activités biochimiques (inhibe la réponse pro-inflamatoire, module le trafic intra- cellulaire,.. ) Nécessite un contact cellulaire Exportation des effecteurs Modulation de la fonction des molécules de l'hôte au profit de la bactérie l'exportation des Yops artificiellement déclenché en absence de contact cellulaire, par chélation Ca2+

6 Injectisome Ysc de Yersinia enterocolitica 25 protéines appelées Ysc L'aiguille: tube creux (polymérisation hélicoïdale) YscF L'anneau de la ME: YscC (sécrétine) L'anneau la MI est appelé anneau MS: YscJ (lipoprotéine) YscD: relie les anneaux dans les deux membranes YscR, S, T, U, V: forme lappareil dexport à travers la MI Ysc N ( ATPase) associée à YscK et L (probablement en exerçant un contrôle sur l'activité ATPase) Anneau C: YscQ (lier le complexe ATPase)

7 Grande similarité avec le flagelle suggérant une relation évolutive Injectisome Ysc de Yersinia sup. L'assemblage du flagelle (linéaire et séquentielle) Le scénario proposé (Kubori et al, 1992; Macnab, 2003 ) Anneau MS L'anneau C Composants périplasmique Composants OM Composants extracellulaires (Cornelis, 2006) l'assemblage de l'injectisome? Des modèles dassemblage ont été proposés ( Kimbrough et Miller, 2000) (Sukhan et al, 2001 ) MAIS !! L'ordre exact des étapes de l'Assemblage de linjectisome reste inconnu

8 Objectif Etudier le processus d'assemblage de linjectisome chez Yersinia (Y.enterocolitica E40) greffage des protéines fluorescentes sur différentes parties de la machinerie de linjectisome chez des mutants de délétions

9 RESULTATS

10 Visualisation de linjectisome et ses sous-unités Allèles (wt): yscC, yscD et yscQ (sur le plasmide de virulence de Y.enterocolitica E40) gènes hybrides codant pour les protéines hybrides fluorescentes: YscC-mCherry, EGFP-YscD et EGFP-YscQ Délétion complète non-polaire de yscN complémentée en trans avec un plasmide codant pour l'EGFP-YscN

11 Localisation des protéines hybrides La présence des protéines hybrides à la périphérie des cellules nest pas directement liée à la sécrétion des protéines Yop par T3SS Spots de fluorescence à la périphérie des cellules indépendant de la concentration Ca2+ dans le milieu

12 Fonctionnalité des protéines de fusion Souches: YscC-mCherry EGFP-YscN EGFP-YscQ 1-[Wt] 2-[YscC–mCherry] 3-[EGFP–YscD], 4-[ΔYscN+pBAD–egfp–yscN] 5-[EGFP–YscQ] 6-[EGFP–YscQ, YscC–mCherry] 7-[ΔYscD, control négatif] Analyse de la sécrétion des protéines Yop dans des conditions de sécrétion permissive (BHI ( Brain Heart Infusion), фCa2+) pleinement fonctionnelles Souches EGFP-YscD Faible niveau des protéines effectrices Toutes les protéines de fusion ont permis la formation d'aiguilles

13 Colocalisation de YscQ et YscC EGFP-YscQ fluorescence verte YscC-mCherry fluorescence rouge Colocalisation des taches (vertes et rouges) Les spots fluorescents correspondent à lassemblage du corps basal (La Colocalisation des spots a été également observée pour EGFP-YscD et EGFP-YscN avec YscC-mCherry)

14 Colocalisation de l'aiguille avec les composants du corps basal Immunofluorescence EGFP-YscQ + Ac contre la sous-unité d'aiguille (yscF) La majorité des spots de YscF et YscQ colocalisent l'aiguille est colocalisée avec les composants du corps basal les taches fluorescentes correspondent aux injectisomes fonctionnels

15 Comment procède lassemblage de l'injectisome ??

16 Linsertion de la sécrétine (YscC) dans lME nécessite lassistance de la pilotine (YscW) (Burghout et al, 2004a; Guilvout et al, 2006) YscC mCherry + YscW exprimés en trans dans (pMA8, pRS6) chez Y.enterocolitica E40 en absence de pYV (codant pour les composants de T3S) YscC-mCherry localisée dans la membrane Confirmation des résultats antérieurs montrant que: YscC exige uniquement la pilotine (YscW) pour l'assemblage au niveau de l'ME YscW permet la localisation et loligomérisation des YscC

17 Mutants YscC-, YscD- ou YscJ- incapables dassembler les composants cytosoliques YscN et YscQ L'établissement des structures transmembranaires formées par YscC, YscD, et YscJ se fait au début de la formation de linjectisome Etude de la formation des spots membranaires en absence de différentes protéines

18 Chronologie de l'assemblage de YscC, YscD, et YscJ Lallèle egfp-yscD (pYV) + délétions non-polaires dans yscC ou yscJ. ΔYscC Pas de formation de spot dEGFP-YscD à la membrane bactérienne ΔYscJ Pas deffet sur lassemblage YscC sinsère le premier, suivi par YscD, et enfin YscJ

19 mauvaise localisation en absence de YscC un niveau plus faible expression Confirmation de lordre dassemblage: YscC YscD YscJ Copurification de YscC et YscD avec YscJ-tag Copurification de YscC et YscJ avec YscD-tag Chronologie de l'assemblage de YscC, YscD, et YscJ

20 L'insertion de l'anneau de sécrétine dans l'ME est nécessaire pour l'association de YscD et YscJ YscD fait le lien entre YscC et YscJ Chronologie de l'assemblage de YscC, YscD, et YscJ ?

21 Formation de l'anneau C

22 L'anneau C se forme après lassemblage des anneaux membranaires (YscC, YscD, YscJ) Formation de lanneau C L'assemblage de l'anneau C requiert en outre ATPase YscN ainsi que les protéines YscK et YscL associées

23 Formation de lanneau C L'assemblage de l'anneau C requiert la présence des protéines structurales des anneaux membranaires (YscCDJ) et du complexe ATPase (YscNKL)

24 Formation de lanneau C L'anneau C sincorpore uniquement en présence des anneaux membranaires (YscCDJ), et le complexe ATPase (YscNKL)

25 L'assemblage de lATPase YscN ?

26 L'assemblage de lATPase YscN Lassemblage de lATPase exige la présence de la plate-forme YscCDJ de YscK de YscL et YscQ (anneau C)

27 les composants cytosoliques forment un seul grand complexe ATPase-anneau C L'anneau C sincorpore uniquement en présence des anneaux membranaires (YscCDJ), et le complexe ATPase (YscNKL) Lassemblage de lATPase exige la présence de la plate-forme YscCDJ de YscK de YscL et YscQ (anneau C)

28 L'activité ATPase de YscN est-elle nécessaire pour l'assemblage du complexe ATPase-anneau C ?

29 L'assemblage de l'anneau C nécessite YscN comme une composante structurelle YscN(K175E) restaure la formation des spots de l'anneau C Les exigences de YscN pour la formation du complexe ATPase-anneau C est exclusivement structurelle.

30 YscN(K175E) n'était pas fonctionnel Rôle de lactivité ATPasique de YscN dans le transport des substrats de linjectisome Lactivité ATPase est nécessaire pour la sécrétion: Des sous-unités de laiguille Des régulateurs Des protéines effectrices (Yop)

31 Chronologie de la formation de lanneau C, de laiguille et de la sécrétion des effecteurs

32 La cinétique de formation de l'anneau C, l'aiguille et sécrétion des effecteurs La synthèse de YscQ a été rapidement activée juste après le shift de la température le délai d'apparition de l'anneau C est similaire à celui de lapparition de laiguilles et la sécrétion des effecteurs

33 Conclusions et Discussion L'assemblage de linjectisome (T3SS) est un processus complexe qui engage plus de 25 protéines différentes Formation d'une nano-machine traversant les deux membranes bactériennes et se prolongeant hors de la bactérie Modèle proposé pour le flagelle (Kubori et al, 1997; Macnab, 2003) Processus dassemblage mal connu Même schéma général d'assemblage chez Salmonella enterica Lanneau de lMI sassemble d'abord, puis fusionne avec l'anneau de sécrétine dans l'ME (Kimbrough et Miller, 2002) N'explique pas comment les deux anneaux membranaires se rejoignent Les étapes ultérieures d'assemblage ??

34 Construction des souches dans lesquelles un certain nombre des constituants de linjectisome ont été fusionnés à des protéines fluorescentes Tous les injectisomes recombinants sont fonctionnels Conclusions et Discussions microscopie de fluorescence et de co-immunprecipitation YscD est le connecteur entre les deux anneaux membranaires cohérent avec la structure cristalline et des données récentes de modélisation (Spreter et al, 2009) YscC sassemble en premier (en présence de YscW) dans la ME, suivi par YscD et enfin YscJ

35 Différent du rapport précédent (Kimbrough et Miller, 2000) PrgH et PrgK, les homologues de YscD et YscJ de Salmonella, peuvent former un anneau indépendamment de YscC Différent du rapport (Schuch et Maurelli, 2001): MxiD et MxiJ, les homologues YscC et YscJ de Shigella, interagissent même en absence du connecteur (YscD) Ces différents modèles suggèrent une évolution convergente dans le processus de formation de ces systèmes d'exportation chez les procaryotes Conclusions et Discussions YscC YscD YscJ

36 Formation dun grand complexe cytosolique ATPase-anneau C (YscN, YscK, YscL, YscQ) qui nexige pas lactivité ATPase de YscC En parfait accord avec des résultats montrant les interactions entre YscK, yscL, YscN et YscQ (Jackson et Plano, 2000) Conclusions et Discussions Après l'assemblage des anneaux de l'ME et de l'MI, les composants cytosoliques peuvent sassembler sur ces structures.

37 Modèle d'assemblage de linjectisome ????

38 On sait peu sur la stœchiométrie, et la chronologie dinsertion des protéines formant lappareil dexport à travers la MI, au cours du processus d'assemblage de linjectisome Perspectives


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