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Master 1: 13 Avril 2011 Cellules Immunocompétentes CS Hématopoïétique CS lympho ïde CS myélo ïde Progéniteur Granulocytes Monocytes Polynucléaires PN/PE/PB.

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2 Master 1: 13 Avril 2011

3 Cellules Immunocompétentes CS Hématopoïétique CS lympho ïde CS myélo ïde Progéniteur Granulocytes Monocytes Polynucléaires PN/PE/PB Monocytes Macrophages Dendritiques Lymphocytes B Lymphocytes T Cellules NK Moelle osseuseSang

4 Exploration de l immunite à médiation cellulaire Diagnostic des déficits immunitaires primitifs Caractérisation et suivi des déficits immunitaires secondaires Objectifs

5 Exploration de l immunite à médiation cellulaire Elément clé dans la réponse immune adaptative L é tude des lymphocytes permet l identification et la séparation de sous populations fonctionnellement distinctes Le lymphocyte

6 Sources de lymphocytes Sang veineux périphérique +++ Les lymphocytes peuvent être étudiés après lyse des globules ou Les lymphocytes sont isolés par centrifugation sur gradient de ficoll Seuls les lymphocytes recirculants sont accessibles

7 Exploration de l immunite à médiation cellulaire Gradient de ficoll

8 Sources de lymphocytes Organes lymphoïdes (Animaux d expérience, occasionnellement chez l homme) Rate Thymus Ganglion lymphoïde Tissu lymphoïde associé à l intestin: GALT Tissu lymphoïde associé aux bronches: BALT Tissu lymphoïde associé aux muqueuses: MALT Autres: épithélium, réaction locale (ex: Synovie pour la PR)

9 Lymphocytes: Caractérisation dans le sang périphérique Morphologie: Haut rapport nucléo-cytoplasmique Noyau à chromatine mottée 12 um Cytoplasme petit, basophile, quelques (peu) granulations azurophiles

10 Les cellules lympho ïdes portent sur leur membrane de nombreux antigènes Ces antigènes sont identifiables grâce à des anticorps monoclonaux Certains antigènes sont des marqueurs de différenciation Immunophénotypage lymphocytaire

11 La cytométrie en flux a une définition très large. C est un système pour mesurer et analyser les signaux émis par des particules entraînées par un courant et examinées une par une à travers un faisceau de lumière. CMF: Définition

12 La cytométrie en flux 3 exigences Analyse individuelle des cellules comme au microscope Analyse rapide de très nombreuses cellules, ce qui permet d accroître la fiabilité statistique Analyse plus précise Chaque paramètre est quantifié avec précision Etude simultanée de plusieurs paramètres

13 La CMF analyse les interactions des cellules avec un faisceau de lumière (laser) Les signaux lumineux engendrés dépendent - De caractéristiques propres aux cellules - De la présence de marqueurs chimiques ayant réagit avec ces cellules Bases de la CMF

14 è Une source de lumière. Le ban optique permet de diriger et de focaliser le faisceau de lumière. è Un système fluidique. Courants liquides pour entraîner et réguler le flot de particules afin de centrer les particules par rapport au faisceau lumineux. è Un matériel électronique pour mesurer l intensité des signaux lumineux, enregistrer conserver et réinterpréter les informations, trier les cellules lorsqu un module trieur est associé à l analyseur. è Un ordinateur pour analyser les signaux lumineux et les comparer entre eux. Lanalyseur en cytométrie

15 Paramètres étudiés en CMF

16 Les lumières diffusées - forward scatter : FS - Side scatter : SS Les fluorescences Paramètres étudiés en CMF

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18 Répartition cellulaire en CMF

19 Grâce aux anticorps monoclonaux, il est possible de détecter à la surface des cellules (mais aussi dans le contenu cytoplasmique) la présence de marqueurs. Ces anticorps sont couplés à des substances fluorescentes, ce qui les rend détectables. Les fluorescences en CMF

20 Histogramme monoparamétrique

21 Histogrammes biparamétriques

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23 - + Tri cellulaire Tube de collecte Laser Plaques de déflexion Veine liquide dentraînement Non sélectionnées

24 Caractérisation des cellules en cytométrie de flux Les différentes populations cellulaires sont identifiées et distinguées au moyen d anticorps spécifiques de leurs molécules de surface. La CMF permet aussi de compter les cellules daprès leurs antigènes de surface Les lymphocytes T matures: CD2-CD3 Lymphocytes T auxiliaires: CD4 Lymphocytes T suppresseurs/cytotoxiques: CD8 Cellules NK: CD56-CD16 Lymphocytes B: CD19-CD20 Monocytes: CD14

25 Immunophénotypage 5 couleurs: CD45-CD3-CD4-CD8-CD20

26 Immunophénotypage 5 couleurs: CD45-CD2-CD56-CD19-CD3

27 Fénêtrage en CMF

28 -De très nombreux anticorps ont été produits -Certains reconnaissent la même molécule sans cependant être dirigés contre le même épitope -Des ateliers internationaux (Workshop) ont permis de comparer ces Acs et de regrouper les Ags quils reconnaissent en classe de différenciation (CD) Les antigènes de différenciation

29 Marqueurs des lymphocytes T TCR CD2, CD5, CD7 CD3 CD4 CD8 CD28 CD40L CD25 LFA1, ICAM-1 CD45 RA/RO Récepteur de lAg Marqueurs de lignée T Transduction du signal Liaison MHC II Liaison MHC I Co-activation/B7 Co-activation CD40 Récepteur à lIL2 Molécules dadhésion Marqueurs de différenciation

30 Marqueurs des lymphocytes B BCR CD19, CD20 CD79a/CD79b CD21 CD22, CD72 CD40 CD80/86 Récepteur de lAg Marqueurs de lignée B Transduction du signal Récepteur C3d/EBV Molécules dadhésion Co-activation /CD4OL Co-activation /CD28

31 Caractérisation des cellules en cytométrie de flux Comparaison compartiment mémoire et naïf CD45RO/CD45RA, CD62L, CD27 Marqueurs dactivation (CD25, CD69) Cellules présentatrices (CP) : cellules dendritiques (CD myéloïdes et plasmacytoïdes), monocytes, lymphocytes B (CD11c/CD11b, CD123, DR, CD14, CD19)

32 Caractérisation fonctionnelle des lymphocytes lymphocytes B naïfs (CD27 -, IgM +, IgD +) lymphocytes B mémoires (CD27 +, IgM - IgD -) lymphocytes B immatures (CD27 +, IgM +, IgD +) lymphocytes T régulateurs (CD4+, CD25+, FoxP3+)

33 Marqueurs des cellules NK KIR, LIR, CD94 NKp44,46,30,NKG2D CD16 LFA-1, CD18/11, CD56 CD2 RIL2, RIL12, RIL15.. NK Récepteurs /CMH I Récepteurs de cytotoxicité Récepteur Fc IgG Molécules dadhésion Co-activation Récepteurs de cytokines CD3-, CD56+et/ou CD16+

34 Compartiments cellulaires du système immunitaire Seuls 2% des lymphocytes totaux se retrouvent dans le sang circulant. Les cellules recirculent en permanence des tissus lympho ïdes vers le sang, la lymphe puis retour aux organes lymphoïdes. La majorité des cellules se trouvent temporairement dans les organes lymphoïdes I (MO, thymus) ou II (rate, ganglion, plaque de Peyer) Les relations entre les taux de lymphocytes dans le sang et les différents tissus ne sont pas connues

35 Répartition tissulaire des lymphocytes Lymphos TLymphos BCellules NK Sang périphérique 70-80%10-15% Moelle osseuse 5-10%80-90%5-10% Thymus99%<1% Ganglion70-80%20-30%<1% Rate30-40%50-60%1-5%

36 Méthodes de séparation des lymphocytes FACS: Fluorescence activated cell sorter Rosette E: Les cellules T se lient sélectivement à des globules rouges de mouton formant des rosettes.Une couronne de GR se forme autour des Lymphocytes T qui sédimentent et se séparent des autres cellules. Microbilles: Des microbilles magnétiques recouvertes d anticorps monoclonaux spécifiques d un marqueur membranaire sont mises en présence de la suspension cellulaire. Le tube est alors placé dans un champ magnétique puissant qui retient les billes et les cellules qui y sont attachées Paning ou élimination des cellules porteuses d un marqueur à l aide d Acs fixant le complément

37 Tri sur microbilles

38 Evaluation fonctionnelle des lymphocytes T Réactions d hypersensibilité retardée Réactions d HSR in vivo Test tuberculinique Test au DNCB

39 Intradermoréaction Lecture : taille de linduration à heures Antigènes: Tuberculine Candidine Anatoxine tétanique Anatoxine diphtérique Trychophyton

40 Proliférations lymphocytaires Au cours de la réponse adaptative, des lymphocytes spécifiques de lantigène vont proliférer avant de se différencier en cellules effectrices. La phase de prolifération est indispensable pour engendrer un nombre de cellules effectrices suffisant. A la différence de la plupart des autres cellules de lorganisme les lymphocytes natteignent le stade terminal de leur différenciation quaprès avoir été stimulés par un antigène

41 Proliférations lymphocytaires Il est difficile de détecter la prolifération de lymphocytes normaux en réponse à un antigène spécifique, parce que seule une proportion très faible de ces cellules va être stimulée et se diviser. Certaines substances, les mitogènes induisent la prolifération de beaucoup de lymphocytes voir de tous Si la stimulation par les mitogènes est non spécifique, cependant elle déclenche une réponse cellulaire identique à la réponse observée en cas de stimulation antigénique

42 Les mitogènes La plupart des mitogènes polyclonaux sont des lectines dorigine végétale ou animale. Ils sont très utiles pour étudier la capacité des lymphocytes à répondre à un stimulus non spécifique. Certaines lectines peuvent présenter une certaine spécificité à légard dun type cellulaire

43 Mitogènes non spécifiques Concanavalline A: ConA (T) Phytohémagglutine: PHA (T) Pokeweed mitogen: PWM (T et B) Extrait de Nocardia opaca: NWSM

44 Autres activateurs polyclonaux Anticorps: Anti-cellules T: anti CD3 Anti-immunoglobulines Endotoxines bactériennes (B) Protéine A du staphylocoque (B) Sulfate de dextran (polysaccharide) Virus: EBV

45 Sélectivité des activateurs La PHA (phytohémagglutinine A) et la ConA (concanavaline A) sont spécifiques des cellules T Les endotoxines activent électivement les lymphocytes B Le Pokeweed stimule à la fois les cellules T et les cellules B. Lactivation des cellules B par les endotoxines et la protéine A du staphylocoque ne nécessite pas la présence de cellule T alors que celle induite par le pokeweed la requiert.

46 Proliférations lymphocytaires spécifiques Réponse allogénique: la réaction lymphocytaire mixte: met en présence des cellules T répondantes et des cellules stimulantes irradiées Ne nécessite pas de préimmunisation Réponse antigénique après présensibilisation in vivo Vaccination antérieure Infection fréquente

47 Mise en évidence de lactivation Observation des cellules au microscope Mesure de lincorporation de précurseurs radiomarqués dADN (thymidine tritiée), dARN ou des protéines dont la synthèse est augmentée. Incorporation de BrdU Analyse du cycle cellulaire Diminution du CFSE

48 Le cycle cellulaire La phase G0 correspond à un état de repos. Au cours de la phase G1 la cycle entre en cycle. La taille de la cellule augmente, ainsi que son contenu en ARN et en protéines. Au cours de la phase S la cellule synthétise de lADN La phase G2 précède le stade M qui correspond à la division de la cellule-mère

49 Fonction effectrice des LyT La fonction effectrice des LyT peut être évaluée par le dosage de médiateurs tels que cytokines et cytotoxines Le dosage des cytokines peut être réalisé par ELISA sandwich ou test ELISPOT

50 Mesures de la production d interleukines Méthodes: RIA ELISA Luminex CMF Elispot: sécrétion Effet biologique

51 Différenciation des lymphocytes T CD4+ TH0 IL-2 IL-4 IFN TH2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 TH1 IL-2 IFN TNF Lymphocytes T CD4 auxiliaires Lymphocytes T CD4 inflammatoires

52 Cytotoxicité non restreinte au CMH Les cellules NK Morphologie: Lymphocyte de grande taille Phénotype: CD56+; CD57+; CD16+; CD3- Cible cellulaire:lignée K 562-

53 Etude des fonctions des cellules phagocytaires Locomotion Capacité d ingestion Métabolisme oxydatif Bactéricidie Sécrétion de cytokines

54 Etude de ladhérence Expression des molécules dadhérence à la surface des PN Sang total à +4°CEtat de base + fMLP à 37°CCapacité de réponse des PN Ac anti-CD15, CD11b, CD18, CD62L Repos Stimulation

55 Etude du mouvement

56 Etude du contenu des granules Morphologie: Aspect des PN sur frottis Mesure de la capacité à dégranuler après stimulation CMF: CD11b, CD35… ELISA: libération du contenu granulaire dans le milieu extracellulaire Histochimie: mesure des différents marqueurs des granulations granulations azurophiles: MPO granules spécifiques: CD11b granules sécrétoires: CD35

57 Etude de lingestion Adhérence de E.Coli à la surface des cellules phagocytaires : CMF Ingestion de levure: MO Ingestion de E. Coli opsonisées: CMF

58 Etude du métabolisme oxydatif Activation des phagocytes par des stimuli Solubles: PMA, fMLP, endotoxine Particulaires: zymosan, bactéries opsonisées Mesure de la production globale des formes réactives de loxygène Réduction du cytochrome c: spectrophotométrie Chimioluminescence Evaluation du % des PN produisant des FRO Réduction cytochimique du NBT CMF

59 CONCLUSION: Applications futures Ces nouveaux examens permettront d'améliorer la prise en charge de certaines pathologies: * La transplantation d'organe. Prévention du rejet Surveillance des traitements IS * Caratérisation des déficits immunitaires, MAI * Mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'induction de la tolérance * Cancers, maladies auto-immunes, maladies chroniques ou tout simplement dues au grand âge,

60 Merci pour votre attention….


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