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La cytométrie en flux La Cytométrie Mesure des cellules Comparaison déchantillons Paramètres physiques Paramètres chimiques (sondes fluorescentes) Paramètres.

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2 La cytométrie en flux La Cytométrie Mesure des cellules Comparaison déchantillons Paramètres physiques Paramètres chimiques (sondes fluorescentes) Paramètres biologiques Microscope, photos numériques Le Flux Dénombrement de particule Passage une à une devant le détecteur Liquide en mouvement

3 La cytométrie en flux Le Principe Le laser La focalisation hydrodynamique La focalisation du laser La diffraction du laser Séparation des signaux Les résultats

4 La cytométrie en flux Le principe : le laser laser Argon 488nm Raie lumineuse monochromatique Un seul type de photons (dans le bleu) Forme elliptique après focalisation Faisceau déclairement très concentré COULTER® EPICS® XL

5 La cytométrie en flux Le principe : la focalisation hydrodynamique P2 d1 d2 d1 >> d2 P1 P2>P1

6 La cytométrie en flux Le principe : la focalisation hydrodynamique ml de cellules 10 6 /ml: 12 µm de diamètre colonne de cellules de 9 km 1 cellule / 0.9 cm Manchon liquidien : 50 à 100 µm Suspension cellulaire : 10 à 15 µm 12

7 La cytométrie en flux Le principe : la focalisation du laser FOCALISATION LASER Lentilles de focalisation Le diamètre d'un faisceau laser : 0,7 mm peu précis 2 lentilles permettent de focaliser le laser de manière à obtenir un faisceau elliptique proche, en taille, des événements à analyser : TRES PRECIS TRES PRECIS

8 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion axiale photodiode e-Ve-V

9 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion axiale Diffusion dans laxe Forward scatter (FS, FSc) Diffraction ++ Réflexion +/- Réfraction +/- Taille des particules

10 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion latérale i1 i2 Réflexion Réfraction

11 La cytométrie en flux Le principe : la diffusion latérale Diffusion à angle droit Side scatter (SS, SSc) Diffraction - Réflexion ++ Réfraction + Hétérogénéité du contenu cellulaire

12 La cytométrie en flux Le principe : la diffraction du laser Laser Diffusion axiale Diffusion latérale + fluorescence

13 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux Spécificité relative Fluorochrome spécifique pour un constituant de la cellule Toutes les cellules marquées Ac.Nucléiques Protéines Ions Spécificité absolue Fluorochrome lié à une molécule biologique Substrat fluorogène Ligands: FC, AnV, lectines Anticorps

14 La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux Sondes fluorescentes: plusieurs fluorescences pour chaque cellule Fluo1 Fluo2 Fluo3 Filtres optiques

15 Filtres interférentiels Miroirs dichroïques Filtres colorés absorbants La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux

16 500nm800nm700nm600nm FITC PE ECD PECy5 Emission Relative Fluorescence La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux

17 D1D2 D3 D5 D4 D1, D2, …: photomultiplicateurs La cytométrie en flux Le principe : la séparation des signaux

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19 La cytométrie en flux Les résultats : la chaîne dacquisition h Ampli eV PMT 0V 10V CAD

20 La cytométrie en flux Les résultats : Digitalisation / Histogramme N Intensité du signal

21 N intensité de fluorescence01023 N % Moy, CV,... La cytométrie en flux Les résultats : analyse dhistogramme

22 Histogramme de Distribution N intensité - graphe - courbe - profil Spectre de fluorescence intensité

23 moy ? Représentation des résultats sous forme dhistogrammes de distribution de fréquence. Analyses de populations dans des échantillons hétérogènes La cytométrie en flux Les résultats

24 La cytométrie en flux Les résultats : Histogramme bi paramétrique N Paramètre 1 Paramètre 2

25 La cytométrie en flux Les résultats : Histogramme bi paramétrique

26 La cytométrie en flux Les résultats : Combinaison de paramètres paramètre1paramètre2

27 La cytométrie en flux Les résultats : Conditionnement de lanalyse Diffusion Axiale Diffusion latérale Diffusion Axiale

28 La cytométrie en flux Les résultats : Conditionnement couleur Diffusion latérale Diffusion axiale Diffusion latérale Diffusion axiale

29 diffusion laser fluo1 fluo2 fluo3 électronique La cytométrie en flux Synthése

30 La cytométrie en flux Les résultats : immunofluorescence Excellente spécificité (Ac) théorique Nombreux contrôles nécessaires Spécificité de lAnticorps Fixation non spécifique pour lantigène Affinité

31 La cytométrie en flux Les résultats : Le contrôle négatif Ac négatif Ac marqueur 1 2 Lecture dérivée des observations au microscope

32 La cytométrie en flux Applications : Analyse CD4 / CD8 Diff. Latérale Diff. Axiale Anti-CD8 Anti-CD4 Sang Lyse des GR

33 65% 20% La cytométrie en flux Applications : Analyse CD4 / CD8

34 La cytométrie en flux Applications : Analyse des leucémies Diffusion latérale CD45 Leuco Ery

35 La cytométrie en flux Applications : Analyse du cycle cellulaire Marqueurs de lADN Intercalants Spécificité relative

36 G1 M Dnr G1 M Colc G1 M Cam G1 M Fluorescence proportionnelle à ADN La cytométrie en flux Applications : Analyse du cycle cellulaire

37 La cytométrie en flux Applications : Analyse de lapoptose Marqueurs membranaires Marqueurs mitochondriaux Marqueurs enzymatiques

38 La cytométrie en flux Applications : Marquage Annexine V-FITC -phospatidylsérines -Annexine V-FITC Apoptose Intactes Nécrose Iodure de propidium vert rouge

39 Témoin CHX TNFTNF+CHX IP AnV Apotose Apotose tardive ou nécrose La cytométrie en flux Applications : Marquage Annexine V-FITC / IP

40 La cytométrie en flux Le tri par CMF Cellules en suspension dans un jet de liquide Formation de goutellettes Charge Electrostatique Déviation des gouttelettes

41 Technologie dérivée des imprimante à jet d encre Jet de liquide instable dans l air gouttelettes Oscillations modifient le point de rupture La cytométrie en flux Le tri par CMF : La formation de gouttelettes

42 30kHz d=Cte La cytométrie en flux Le tri par CMF : La formation de gouttelettes

43 t (µs) ? ? La cytométrie en flux Le tri par CMF : La Charge des gouttelettes

44 La cytométrie en flux Le tri par CMF : La déviation des gouttelettes V

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46 +3000 V-3000 V Cellules Liquide de veine +/- Electronique Détecteur

47 La cytométrie en flux Le tri par CMF Technique longue Sélection sur plusieurs paramètres à la fois Choix entre pureté et rendement Bonne pureté >95% Clonages Préparations pour : Mise en culture Biologie moléculaire Western blots Activité enzymatiques Etc …

48 La cytométrie en flux Le tri par CMF: Tri des cellules NK 99% CD56+ 1,3% CD56+ CD56 SSc Enrich t rosette Tri CMF 64% CD56+

49 0 h 3 h neg low high Jurkat 7C11 La cytométrie en flux Le tri par CMF: Inhibiteurs des caspases


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