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1 Le nucléosome ADN et chromosome. 2 Solomon,D 2004, Nat cell Biol : Heterochromatic domains in a mouse nucleus Dimethylated Lys 9 of Histone H3 is shown.

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1 1 Le nucléosome ADN et chromosome

2 2 Solomon,D 2004, Nat cell Biol : Heterochromatic domains in a mouse nucleus Dimethylated Lys 9 of Histone H3 is shown in green, the Swi/Snf core ATPase Brg1 in red, and DNA in blue. The image was obtained using a Nikon Microphot FX fluorescence microscope. Scale bar represnts 3 µm. The winner would like to acknowledge the support of his advisor, Erik Knudsen, and technical assistance from Nancy Kleene (both at the University of Cincinnati College of Medicine, USA). 3 m Domaines hétérochromatiques dans un noyau de souris

3 3 Plan I - Structure et fonction de l'ADN II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne –organisation des gènes le long de la molécule d'ADN III - Structure globale des chromosomes –emballage de la molécule d'ADN dans les chromosomes

4 4 III - Structure globale des chromosomes 1. Chromosomes en écouvillon 2. Chromosomes polytènes de la drosophile 3. Hétérochromatine / Euchromatine a – État de la chromatine expression des gènes b – Télomères c – Centromères d - Défense contre les éléments mobiles d'ADN 4. Chromosomes mitotiques 5. Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique

5 5 Structure globale des chromosomes (Rappel) I - ADN II - Nucléosomes 30nm (0,1 cm de long) III - 30nm organisation supérieure même en interphase –Mal compris : boucles, enroulements

6 6 1 - Chromosomes en écouvillon Dans une cellule en interphase, on ne voit pas les chromosomes (trop petits et trop emmêlés) MAIS il y a quelques exceptions où on voit l'organisation supérieure des chromomes ET on pense que certaines caractéristiques sont représentatives pour tous les chromosomes Un exemple : les chromosomes appariés de l'ovocyte d'amphibien –très actifs en transcription –forment des boucles de chromatine rigides et déroulées – le nom de chromosome en écouvillon –visibles en microscopie optique

7 7 Fig 4-36(A) Chromosome en écouvillon (4 molécules d'ADN par chromosome) Microscopie optique 0,1 mm

8 8 Fig 4-36(B) 20 m Microscopie optique à fluorescence AC contre les protéines de maturation de l'ARN La plupart des gènes portés par la boucle d'ADN est en cours d'expression

9 9 Fig 4-37 Structure du chromosome en écouvillon –Environ boucles au total –La plupart de l'ADN est condensé en chromomère –Chaque boucle correspond à une séquence d'ADN spécifique –4 copies de chaque boucle (diplotène)

10 10 Chromosomes en écouvillon : illustration du phénomène suivant La chromatine dont l'ADN est utilisé est décondensée La chromatine dont l'ADN n'est pas utilisé est condensée

11 11 Applications du modèle chromosomes en écouvillon Dans les chromosomes en écouvillons correspondance précise Mais rarement observé dans les autres espèces

12 12 Applications du modèle chromosomes en écouvillon De l'ADN de poisson (sans chromosomes en écouvillons) prend la forme de chromosomes en écouvillon quand on l'injecte dans l'ovocyte d'amphibien hypothèse : Les chromosomes en interphase de tous les eucaryotes sont organisés en boucles trop petites et trop fragiles pour être observables

13 13 Applications du modèle chromosomes en écouvillon Modèle d'étude pour l'ADN de mammifère qu'on injecte dans un ovocyte d'amphibien Corrélation –boucle –gène –séquence d'ADN

14 Chromosomes polytènes de la drosophile Autre exemple de chromosome interphasique visible au microscope optique Plusieurs milliers de molécules d'ADN par chromosome = chromosome polytène chromosome polytène = 1 chromosome avec beaucoup de molécules d'ADN Cellule polyploïde = plusieurs lots de chromosomes avec chacun une molécule d'ADN

15 15 Chromosomes polytènes de la drosophile Très étudié dans les cellules des glandes salivaires de larve de drosophiles 10 réplications sans séparation des 4 chromosomes 2 10 (= 1024) molécules d'ADN par chromosome

16 16 Fig 4-38 Lot complet de chromosomes polytènes dans une cellule de glande salivaire de drosophile 4 paires de chromosomes différents (2n = 8) Chaque paire est appariée chaque paire apparaît comme une seule structure

17 17 Fig m Microscopie optique d'une portion de chromosome polytène Alternance de bandes sombres (95% de l'ADN) et d'interbandes claires (5% de l'ADN) Une bande ou interbande = 1024 séquences d'ADN alignées en phase Une bande = à paires de nucléotides Chaque bande est reconnaissable et numérotée Environ bandes et interbandes

18 18 Fig 4-40 Microscopie électronique de chromosome polytène Chromatine plus condensée ou contient plus de protéines ou les deux Chromatine moins condensée

19 19 Signification des bandes et des interbandes Toujours pas de réponse claire depuis 1930 On a pensé que (faux) –nombre de bandes nombre de gènes –une bande un gène En fait c'est faux et –Nombre de gènes 3 X nombre de bandes –On trouve des gènes dans des bandes et interbandes –Certaines bandes ont plusieurs gènes –Certaines bandes n'ont pas de gènes

20 20 Signification des bandes et des interbandes actuellement Bande / Interbande est le reflet de différents niveaux d'expression génique Interbandes –chromatine moins compacte –gènes plus exprimés Bandes –chromatine plus compacte –gènes moins exprimés Le chromosome polytène est le reflet de la nature hétérogène de la compaction de la chromatine de tous les chromosomes interphasiques

21 21 Ecdysone Hormone stéroïde qui contrôle l'expression des gènes des chromosomes polytènes de la drosophile Taux montent et descendent en fonction du dévelopement larvaire –si le taux monte les gènes codant pour les protéines s'expriment

22 22 Boursouflures chromosomiques (= "puffs" = nodules) Au fur et à mesure du dévelopement des boursouflures chromosomiques apparaissent puis disparaissent quand de nouveaux gènes s'expriment ou s'éteignent Un puff décondensation d'une bande

23 23 Fig 4-41 Renflements chromosomiques (bras gauche du chromosome 3) : apparition et disparition des renflements chromosomiques le long du chromosome polytène Chacun des 5 "puff" n'est actif que pendant une courte période 22 heures

24 24 Anneaux de Balbiani "Puff" particulièrement grand d'un chromosome polytène Arrangement de la chromatine en boucles (comme dans les chromosomes en écouvillon) Visibles en microscopie électronique Surtout (que) dans les cellules des glandes salivaires du moucheron Chironomus tentans Chaque boucle contient un gène unique

25 25 Fig 4-42(A) Synthèse d'ARN dans un "puff" chromosomique (Chironomus tentans) AC anti BrU Nouvel ARN à partir d'un anneau de Balbiani ARN synthétisés avant l'addition du BrUTP ayant diffusé de l'anneau de Balbiani ARN synthétisés à partir d'un l'anneau de Balbiani avant l'addition du BrUTP

26 26 Fig 4-42(B) Un "puff" d'un chromosome polytène

27 27 Fig 4-43(gauche) Chromosome polytène de Chironomus tentans Coupe dans un anneau de Balbiani (l'ensemble est un "puff")

28 28 Daneholt,B2001p7012 Salivary gland cells in the larvae of the dipteran Chironomus tentans offer unique possibilities to visualize the assembly and nucleocytoplasmic transport of a specific transcription product. Each nucleus harbors four giant polytene chromosomes, whose transcription sites are expanded, or puffed. On chromosome IV, there are two puffs of exceptional size, Balbiani ring (BR) 1 and BR 2. A BR gene is 35–40 kb, contains four short introns, and encodes a 1-MDa salivary polypeptide. The BR transcript is packed with proteins into a ribonucleoprotein (RNP) fibril that is folded into a compact ring-like structure. The completed RNP particle is released into the nucleoplasm and transported to the nuclear pore, where the RNP fibril is gradually unfolded and passes through the pore. On the cytoplasmic side, the exiting extended RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the ensuing polysome is anchored to the endoplasmic reticulum. Several of the BR particle proteins have been characterized, and their fate during the assembly and transport of the BR particle has been elucidated. The proteins studied are all added cotranscriptionally to the pre-mRNA molecule. The various proteins behave differently during RNA transport, and the flow pattern of each protein is related to the particular function of the protein. Because the cotranscriptional assembly of the pre-mRNP particle involves proteins functioning in the nucleus as well as proteins functioning in the cytoplasm, it is concluded that the fate of the mRNA molecule is determined to a considerable extent already at the gene level.

29 29 Daneholt,B2001p7012(fig1) Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl). The arrows mark a few prominent transcription loops (cf. Fig. 2D). (Bar equals 2 μm.)2 Electron micrograph showing chromosome IV with its three giant puffs (Balbiani Rings) in a salivary gland cell from C. tentans. The three BRs (BR1, BR2, and BR3) are indicated as well as the nucleoplasm (Npl) and cytoplasm (Cpl).

30 30 Daneholt,B2001p7012(fig2) Intracellular distribution of the cap-binding protein CBP20 in C. tentans salivary gland cells studied by immunoelectron microscopy. The assembly of the BR RNP particle is shown in A– D: proximal portions of the BR gene are displayed in A, distal portions in B and C, and a schematic drawing of the BR gene in D (p, proximal; m, middle; d, distal portions of the gene). The fate of the released BR particles is shown in E–H: BR particles are present in the nucleoplasm (E), at the pore (F), and in an unfolded conformation when passing through the pore (G and H). Gold particles are marked by arrows and indicate the position of CBP20. It should be noted that gold particles are at the leading 5 end of the BR particle when it passes through the nuclear pore. (Bar equals 100 nm.)

31 31 Daneholt,B2001p7012(fig3) Assembly and transport of the BR RNP particle and its relation to a number of BR RNA-associated proteins. The BR particle is assembled on the gene (left), passes through the nucleoplasm, unfolds, and translocates through the nuclear pore (middle). On the cytoplasmic side, the BR RNP fibril becomes engaged in protein synthesis and the polysomes anchor at the endoplasmic reticulum (right). The tripartite nuclear pore complex with its central channel is seen in black and its nuclear and cytoplasmic fibers are presented in pink. The BR gene with its five exons is displayed above the BR particle scheme, and the flow patterns of the BR RNA-associated proteins are outlined below. snRNP, small nuclear RNP. BR RNA-associated proteins 1, 2, 3, 4, 5 : exons

32 32 Fig 4-42(droite) Boucle de chromatine dans un anneau de Balbiani

33 33 Conclusions sur les anneaux de Balbiani Quand le gène s'exprime, la fibre de chromatine de 30 nm se décondense mais garde ses 4 histones Par défaut la fibre est sous la forme 30 nm Peuvent décondenser cette fibre : –les modifications des histones –les complexes de remodelage de la chromatine –les protéines de régulation de l'expression des gènes La boucle serait un domaine fonctionnel indépendant

34 34 Extrapolation Tout l'ADN des chromosomes polythènes est organisé en boucles qui se condensent et se décondensent Tous les chromosomes interphasiques de tous les eucaryotes sont emballés en boucles contenant quelques gènes dont l'expression est régulée de façon coordonnée

35 35 Fig 4-44 Modèle de structure du chromosome interphasique Déduit à partir de quelques cas rares à paires de nucléotides

36 Hétérochromatine / Euchromatine a.État de la chromatine expression des gènes b.Télomères c.Centromères d.Défense contre les éléments mobiles d'ADN

37 37 Historique (1938) Deux types de chromatine en interphase (MO) –Hétérochromatine : toujours condensée (même en interphase) –Euchromatine : le reste

38 38 Actuellement Euchromatine ( fibre de 30 nm et boucles) Hétérochromatine –contient des protéines supplémentaires –Plus compacte – 10 % du génome est hétérochromatique –Régions spécifiques : centromères et télomères

39 39 Hétérochromatine Son ADN ne contient presque pas de gènes Les gènes emballés dans de lhétérochromatine ne peuvent pas sexprimer Fonctionnement des télomères et centromères Certains gènes ont même besoin dêtre localisés dans de lhétérochromatine pour sexprimer Le mot hétérochromatine comprend plusieurs types de structure de chromatine avec un très haut degré dorganisation Lhétérochromatine nest pas un emballage dADN "mort"

40 40 a - Expression de l'hétérochromatine Un gène qui s'exprime dans de l'euchromatine ne s'exprime plus s'il est localisé dans de lhétérochromatine : il devient "silencieux" exemple d'effet de position Effet de position : l'activité d'un gène dépend de sa position le long du chromosome

41 41 Effet de position Découvert chez la drosophile = influence de l'état de la chromatine le long du chromosome sur l'expression du gène Chromosome = mosaïque de formes différentes de chromatine dont chacune a un effet particulier sur la capacité de l'ADN à être sous le contrôle de la cellule

42 42 Deux exemples de diversification par effet de position 1 - Gène ADE2 de la levure 2 - Gène white de la drosophile

43 43 Exemples de diversification par effet de position 1/2 : Gène ADE2 de la levure Gène ADE2 de la levure –Position normale expression –Position près du télomère (hétérochromatique) pas d'expression ADE2 code pour une enzyme de la synthèse de l'adénine Si absence accumulation de pigment rouge Parfois le gène redevient actif dans la descendance : emballage moins serré de l'hétérochromatine

44 44 Fig 4-45 (A) Exemples de diversification par effet de position : Gène ADE2 de la levure

45 45 Exemples de diversification par effet de position 2/2 : Gène white de la drosophile Le gène white contrôle la couleur des yeux Gène white normal (allèle sauvage white + yeux rouges) Gène white muté (allèle muté white - yeux blancs [d'où le nom]) Le gène white normal (white +) –Position normale expression yeux rouges –Position proche de hétérochromatine pas d'expression yeux blancs –En fait mottes rouges et blanches : présence de rouge car pas d'inactivation pendant la période embryonnaire

46 46 Fig 4-45 (B) Exemples de diversification par effet de position : Gène white de la drosophile

47 47 Deux exemples de diversification par effet de position : gène ADE2 de la levure et gène white de la drosophile Un gène peut se réactiver (colonies rouges et blanches, yeux avec mottes rouges et blanches) Une fois réactivé, transmission aux cellules filles Si emballé avec l'hétérochromatine, inactivation transmises aux cellules filles

48 48 Deux caractères de l'hétérochromatine Dynamique –Peut s'étendre puis se retirer État héritable d'une cellule à la fille –Explique la "diversification par effet de position"

49 49 Fig 4-46(A) ADN limitant empêchant l'hétérochromatine de déborder sur l'euchromatine (peut disparaître au cours de remaniements)

50 50 Fig 4-46(B) Débordement variable de l'hétérochromatine au cours du développement hérité précocément aspect "bariolé" (variegated) de ces mouches

51 51 b – Télomères Le meilleur modèle : S. cerevisiae Pas d'expression de gène à 5000 paires de nucléotides des extrémités des chromosomes : structure hétérochromatique Intervention d'enroulement et de protéines Beaucoup de ces protéines sont connues chez S. cerevisiae : Silent information regulator (protéines Sir)

52 52 Protéines Sir (Silent information regulator) Des mutations dans les protéines Sir empêchent le silence des gènes proches des télomères Découverte d'un complexe de protéine Sir lié au télomère qui reconnaît les queues de certaines histones sous- acétylées

53 53 Fig 4-47(A) Hétérochromatine de l'extrémité des chromosomes de levure H4

54 54 Kimura,A2002p370 Nat Genet(fig5) Model of the role of acetylation of H4–Lys16 in the localization of silencing proteins along chromosomes. a, Model of the region-dependent regulation of the interaction between Sir3p and H4 through the reversible acetylation of H4–Lys16 by Sas2p and Sir2p. b, Model of the function of the chromosomal gradient as a boundary to prevent the spread of silencing proteins. In the wildtype strain (top), the marked increase in the acetylation of H4–Lys16 from the end of the telomere to the telomere-proximal region acts as a steep slope that Sir3p (green spheres) must overcome to diffuse throughout the chromosome. In the absence of Sas2p (middle), acetylation of H4–Lys16 in the telomere-proximal region is decreased, which allows Sir3p to diffuse. In the absence of Sir2p (bottom), deacetylation of H4–Lys16 at the ends of the telomere does not occur, and Sir3p is not retained in this region.

55 55 Suka,N2002p378(fig6) Nat Genet 32,(3):Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin

56 56 Sir2 (Silent information regulator 2) Désacétylase d'histone sous acétylation d'histone propre à l'hétérochromatine emballage plus serré des nucléosomes Très conservée

57 57 Fig 4-47(B) Protéines de liaison à l'ADN spécifiques fixation d'une protéine Sir (Sir2?) le long du chromosome désacétylation des queues d'histones (par Sir2) création de nouveaux sites de fixation de Sir

58 58 Fig 4-48(A) Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine

59 59 Fig 4-48(B) Modèle hypothétique d'héritabilité de l'hétérochromatine

60 60 Rôle des histones méthyl transférases Méthylent des lysines spécifiques (K9 de H3) Lue par les composants hétérochromatiques Assemblage en hétérochromatine

61 61 Intérêt des télomères Protection des extrémités des chromosomes Régulation de la longueur des chromosomes Ségrégation des chromosomes pendant la mitose

62 62 Résumé Modifications covalentes des histones Transmises

63 63 c – Centromères Séquences d'ADN qui permettent la ségrégation des chromosomes Présence dhétérochromatine autour des centromères Centromères inclus dans de grandes étendues d'hétérochromatine où les gènes ne s'expriment pas (si on en met)

64 64 Hétérochromatine centrique (centromérique) Histones –Sous acétylées –Méthylées Autres protéines Modèle d'étude : S. cerevisiae

65 65 S. Cerevisiae 125 paires de nucléotides sont suffisants pour former un centromère Plus une douzaine de protéines Un nucléosome spécifique de centromère

66 66 Fig 4-49 Variant de histone H3 (CENP-A) + H2A + H2B + H4 plus d'autres protéines Nucléosome de centromère chez S. cerevisiae

67 67 Fig 4-49 Chromosomes mitotiques de Drosophile Histone H3 conventionnelle fusionnée avec GFP ( couleur verte de H3) En rouge composant du kinétochore coloré par un AC spécifique

68 68 Fig 4-49 Chromosomes mitotiques de Drosophile Histone H3 spécifique du centromère fusionnée avec GFP ( couleur verte de H3) + En rouge composant du kinétochore coloré par un AC spécifique = Localisation des centromères en jaune

69 69 Organismes complexes Drosophile, humain Centaines de milliers de paires de nucléotides Pas de séquence d'ADN spécifique ADN satellite (petites séquences d'ADN répétées)

70 70 Fig 4-50 Structure d'un centromère humain

71 71 Séquences centromériques Les mêmes séquences d'ADN satellite placées sur d'autres chromosomes ne forment pas de centromères !!! De plus formation du kinétochore ??? Rôle des protéines > rôle de l'ADN ??? Formation et maintien de centromère Formation et maintien de hétérochromatine

72 72 Aspect phylogénétique des centromères Présence d'ADN satellite non fonctionnel sur des chromosomes identique à l'ADN satellite des centromères Phénomène de fusion de chromosomes avec création d'un nouveau centromère qui devient inactif Possibilité de formation de néocentromères sans ADN satellite

73 73 Fig 4-51(AB) Phénomène de fusion de chromosomes avec création d'un nouveau centromère qui est devenu inactif Chromosome surnuméraire qui se crée un centromère sur de l'ADN non satellite

74 74 Fig 4-51(C) Modèle d'explication de la plasticité et de l'héritabilité des centromères

75 75 Plasticité des centromères Formation de complexes de protéines de liaison à l'ADN qui ont plus d'"appétit" pour l'ADN satellite Cette marque pourrait se "perdre" (!!!) Avantage évolutif Évolution des chromosomes par cassure-recollement (cf. évolution)

76 76 d – Défense contre les éléments mobiles d'ADN En résumé –Hétérochromatine courtes séquences répétées d'ADN en tandem (pas de codage de protéines) –Euchromatine riche en gènes à copie unique Mais –Il y a des gènes dans l'hétérochromatine –Il y a des séquences répétées dans l'euchromatine

77 77 Mutité génique induite par la répétition du gène Si on introduit des séquences répétées de gènes dans le génome (souris ou drosophile) –Pas d'expression –Formation d'hétérochromatine Si on introduit la séquence unique du même gène au même endroit –Expression du gène

78 78 Mutité génique induite par la répétition du gène Mécanisme de protection contre l'invasion par les éléments génétiques mobiles Emballage en hétérochromatine et mutisation des éléments pour éviter leur prolifération Même mécanisme pour l'hétérochromatine juxta centromérique ?

79 Chromosomes mitotiques Stade ultime de condensation Seul moment où les chromosomes sont visibles (exception écouvillon, polythènes) Raccourcissement du chromosome interphasique de 10 fois

80 80 4 – Chromosomes mitotiques a – Caryotype b – Emballage de la chromatine dans le chromosome mitotique

81 81 a – Caryotype

82 82 Fig 4-52 Chromosome mitotique typique: 2 chromatides contenant chacune une molécule d'ADN identique générée pendant la phase S du cycle cellulaire

83 83 Fig 4-53 Extrémité d'un chromosome mitotique vue en microscopie à balayage : nombreux domaines en boucle après extraction des complexes de riboprotéines

84 84 Fig 4-54 Microscopie électronique d'un chromosome mitotique Les boucles émanent d'une charpente centrale Boucle gène (très grossièrement)

85 85 Caryotype 46 chromosomes Marquage longitudinal

86 86 Caryotype : bandes G

87 87 Caryotype : bandes G

88 88 Caryotype spectral

89 89 Bras (p ou q) Région (eg : p1) Bande (eg : p11) Sous-bande (eg : p11.2) Sous-sous-bande (eg : p11.23) Caryotype : un chromosome

90 90 Bandes S'observent chez toutes les espèces : humain, drosophile… Très conservées Homme chimpanzé, gorille, orang- outan

91 91 Fig 4-57 Comparaison du plus grand chromosome humain (le 1) avec celui du chimpanzé,du gorille et de l'orang-outan Les chromosomes sont organisés en très grands domaines importants pour leur fonction

92 92 Corrélation bande du chromosome métaphasique bande du chromosome polythène Aucune relation Du début de la mitose à la fin les bandes sont –De moins en moins nombreuses (elles fusionnent) –De plus en plus épaisses

93 93 Corrélation bande du chromosome métaphasique bande du chromosome polythène –La bande la plus fine du caryotype contient plus d'un million de paires de nucléotides ( un génome bactérien) –Bandes plus ou moins riches en GC (ou AT) – à peu près aux bandes des chromosomes

94 94 Zones GC riches –Bandes R –Forte densité en gène –Gènes domestiques –Empaquetage des boucles de chromatine –Plus de molécules qui participent à l'expression des gènes

95 95 Zones AT riches Bandes G

96 96 b – Emballage de la chromatine dans le chromosome mitotique

97 97 Fig 4-55 Emballage de la chromatine

98 98 c - Condensation des chromosomes en mitose Deux conséquences –Individualisation des chromatides –Protection des chromosomes Nécessité des condensines

99 99 Condensines (incluent les SMC) Utilisent de l'ATP Servent à l'enroulement du chromosome interphasique Gros complexes protéiques qui contiennent les protéines SMC (Structural Maintenance of Chromosomes)

100 100 Protéines SMC (sont incluses dans les condensines) Composants d'un complexe de condensine beaucoup plus gros Longues molécules dimériques avec une charnière centrale Domaine globulaire à chaque extrémité ADN + SMC + ATP grandes boucles d'ADN + ADP Composant important des chromosomes mitotiques : une molécule tous les nucléotides

101 101 Fig 4-56 Protéine SMC

102 Organisation des chromosomes dans le noyau interphasique Noyau différent d'un sac à chromosomes En interphase semble désordonné En mitose très orienté –Centromère d'un côté –Télomères de l'autre Dans certains noyaux persistance de cette disposition en interphase : orientation rabl

103 103 Fig 4-58 Racine de plante en interphase en fluo –Centromères en vert –Télomères en rouge

104 104 Fig 4-59 Polymère en solution Embryon de drosophile

105 105 Embryon de drosophile Division cellulaire toutes les 10 minutes Les chromosomes n'ont pas le temps de quitter l'orientation rabl Quand l'interphase est plus longue les chromosomes ont le temps de se replier Ce repliement est lié à des associations spécifiques à l'intérieur de différentes régions d'un même chromosome

106 106 Cellule "commune" Les centromères sont dispersés Chaque chromosome semble avoir une position donnée et son petit territoire : tous les chromosomes ne sont pas emmêlés les uns dans les autres

107 107 Fig 4-60 Chromosome painting de deux chromosomes interphasiques de lymphocytes humains Les deux chromosomes 18 Les deux chromosomes 19

108 108 Croft,A1999p1119(fig1) Human chromosomes 18 and 19 interphase territories. 2D preparations of nuclei, swollen in hypotonic and fixed either with MAA (a-d) or with 4% pFa (e), were hybridized with HSA18 and 19 paints. In the central panels of a-e HSA18 and 19 paints were biotinylated and detected with avidin-FITC (green). In the left-hand panels of a and b, paints were labeled either with biotin and detected with TR (red) or with digoxigenin and detected with FITC (green). All nuclei were counterstained with DAPI (blue). (a) Primary lymphocytes; (b and e) lymphoblastoid cell line; (c) primary fibroblasts; (d) HT1080 fibrosarcoma cells. Bars, 2 µm. On the right, histograms show the mean proportion of DAPI stain (blue bars), and HSA18 (filled bars) and HSA19 (open bars) hybridization signals in each of the five concentric shells of equal area eroded from the periphery (1) to the center (5) of 50 segmented nuclei. Error bars show SEM.

109 109 Croft,A1999p1119(fig2) Fig. 2. Subnuclear localization of HSA18 and 19 in optical sections through 3D-preserved nuclei. Confocal z series (1 µm) of hybridization to 4% pFa-fixed 3D human dermal fibroblasts with paints for either HSA18 (a and b) or HSA19 (c and d), prepared from randomly amplified total DNA from each chromosome and detected with FITC (green-yellow) and counterstained with PI (red). Cells were either untreated (a and c) or treated with DRB (b and d). Bars, 10 µm.

110 110 Croft,A1999p1119(fig3) HSA18 and 19 territories through the cell cycle. (a) Combined FISH and immunofluorescence in 4% pFa-fixed 3D fibroblasts with either chromosome 18 or 19 paints (green) and with antibodies against pKi-67 (red) and B-type lamin (blue). The cells on the left are in early stages of G1 and those on the right in mid G1, S, or G2 based on their pattern of pKi-67 staining (Bridger et al., 1998 ). Bar, 5 µm. (b) FISH for HSA18 or 19 (red) in flattened preparations of MAA-fixed lymphoblast nuclei, pulsed with BrdU (green), and separated by centrifugal elutriation. Blue is DAPI. Bar, 2 µm. FACS® analyses of PI- stained nuclei from elutriated fractions chosen to represent G1, early S, late S, and G2 are shown beneath each panel. Horizontal bars on the FACS® profiles indicate the gating for cells in G1 (left) and for those in S and G2 (right).

111 111 Croft,A1999p1119(fig4) Dependence of territory sizes on transcription and histone deacetylation (a) Frequency histograms of the proportion of nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) in 50 swollen and flattened MAA-fixed lymphoblastoid nuclei. (b) Histograms of the proportion of summed nuclear area occupied by hybridization signals (detected with FITC) of HSA18 (filled bars) and 19 (open bars) through the confocal sections of 5-10 fibroblast nuclei fixed with 4% pFa. Vertical solid and dashed lines show mean proportionate areas for HSA18 and 19, respectively. Cells were either untreated, or treated with AMD, DRB, or TSA before harvest. DRB- treated cells were also grown for 1 h in the absence of DRB (DRB release).

112 112 Croft,A1999p1119(fig5) Fig. 5. The orientation of chromosomes 18 and 19 in normal nuclei and those from a t(18;19). (a and b) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 18p and q arms (Guan et al., 1996 ). 18p is in red in a and in green in b. 18q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (c and d) Lymphoblast nuclei cohybridized with paints specific for 19p and q arms (Guan et al., 1996 ). 19p is in red in c and in green in d. 19q is in the reciprocal color in each case, as indicated. DAPI counterstain is blue. (e) Flattened primary lymphocytes hybridized simultaneously with HSA18 paint (red) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (green) specific for 18pter and qter, respectively. DAPI counterstain is blue. (f) 3D- preserved nuclei cohybridized with HSA18 paint (green) and telomeric clones 52M11 and 75F20 (red). Red signal in the cytoplasm is from endogenous biotin. Telomere signals are apparent with only one of the territories, those associated with the other territory are in a different focal plane. (g) FISH to a metaphase spread from an individual with t(18; 19)(p11;p13) with chromosome 18 material shown in green and 19 in red. The appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. (h and i) Interphase nuclei from t(18;19) cells. HSA18-derived material is detected in green in h and in red in i. HSA19 is detected in the reciprocal color in each panel as indicated. As in g, appropriately colored arrows indicate the derived chromosomes. A line was drawn from the center to the edge of the nucleus passing through each derived chromosome. A second line, perpendicular to the first, was put through the middle of the signal and it was ascertained which side of this line the translocated portion was found. (j) Histograms of the position of the edge of the signal in relation to the edge or the center of the nucleus, in 50 t(18;19) nuclei, for both the normal (open bars) and derived (filled bars) chromosomes 18 and 19. There is no significant difference in the positions of derived and normal chromosomes (P < for HSA18 and P < for HSA19).

113 113 Croft,A1999p1119(fig6) Associations of HSA18 and 19 with nuclear substructure. Lymphoblastoid nuclei extracted with 0.5, 1.0, 1.2, and 1.8 M NaCl, fixed with MAA, and hybridized with alternately labeled chromosome 18 and 19 paints, the color of which is indicated at the right of each panel. DNA was stained with DAPI (shown in blue on the right and in black and white on the left). Chromosome 19 material is retained within the residual nucleus. HSA18 is released into the DNA halo at high salt concentrations. Bar, 2 µm.

114 114 Schémas hypothétiques d'organisation des chromosomes dans le noyau 1.Fixation du chromosome à l'enveloppe nucléaire 2.Existence d'un "nucléosquelette"

115 Fixation du chromosome à l'enveloppe nucléaire Par leurs télomère par exemple Toutefois position non fixe dans le noyau

116 116 Fig 4-61 Noyaux d'embryons de drosophile : localisations de deux régions différentes (jaune et magenta) du chromosome 2 proches de l'enveloppe nucléaire (AC antilamina en vert)

117 Existence d'un"nucléosquelette" (1de2) "Matrice" nucléaire "Charpente nucléaire" (ce qui reste après extraction) Certaines des protéines peuvent se lier à des séquences spécifiques de l'ADN appelées SARs (Scaffold Associated Regions)ou MARs (Matrix Associated Regions)…

118 Existence d'un"nucléosquelette" (2de2) …Formeraient la base des boucles Existence in vivo ? Organisation des chromosomes localisation des gènes expression des gènes


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