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Nouvelle méthode de monitoring in situ du phytoplancton : Analyse automatisée, à haute fréquence et à léchelle individuelle des cellules M. Thyssen, G.Grégori,

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1 Nouvelle méthode de monitoring in situ du phytoplancton : Analyse automatisée, à haute fréquence et à léchelle individuelle des cellules M. Thyssen, G.Grégori, A. Malkassian & M. Denis Laboratoire LMGEM, Centre dOcéanologie de Marseille (OSU) Université de la Méditerranée Campus de Luminy, Marseille Atelier Haute Fréquence, octobre 2009 (Wimereux)

2 Importance des microorganismes marins Le phytoplancton: Principal producteur de matière organique Phytoplancton = premier élément du réseau trophique (entrée du C dans le réseau) Cycles rapides (jusquà plusieurs divisions par jour) Sensibilité aux variations environnementales biotiques (prédation, lyse virale) et abiotiques (hydrologie, vent) Réponse plus rapide à ces changements - Groupe polyphylétique très diversifié (> espèces) - Principalement des organismes photosynthétiques unicellulaires (<1 à ~ µm) - Flottent dans la couche euphotique ~2 % de la biomasse photosynthetique sur Terre ~45 % de la production primaire globale (Field et al., 1998)

3 Flux biogéochimiques : fonction de la structure de la communauté

4 Prise de conscience du rôle des microorganismes

5 Toxicité de certaines espèces © European Communities,

6 Le problème de léchantillonnage Nécessité dun suivi des populations Compréhension de leurs dynamiques à des échelles de temps et despace adéquates. Approche par analyse individuelle et haute fréquence temporelle Neither qualitative nor quantitative surveys generally sample the phytoplankton adequately (Smayda, 1998, Baretta et al., 1998)

7 Méthodologie pour étudier le phytoplancton à léchelle individuelle des cellules (méthode non destructrice) Echantillonnage Analyse traditionnelle Analyse par cytométrie en flux

8 Principe de la cytométrie en flux particules en suspension flux monodisperse interception par un faisceau laser. La diffusion de la lumière et les émissions de fluorescence sont collectées, filtrées et converties en valeurs digitales enregistrées sur un PC. Fluidique Optique Electronique

9 Analyse du phytoplancton (taille <10 micron) Fluo. verte (ua) Diffusion 90°(ua) Fluo. rouge (ua) Prochlorococcus picoeucaryotes Synechococcus picoeucaryotes Synechococcus Billes de calibrage nanoeucaryotes 6-10 microns 3-6 microns Analyse ataxonomique

10 Pourquoi la cytométrie en flux devient populaire chez les microbiologistes? Analyses rapides (plusieurs dizaines de milliers de cellules analysées par seconde) Permet danalyser un grand nombre de cellules Résultats statistiques robustes et représentatifs Analyse multiparamétrique à léchelle individuelle Données quantitatives (corrélation avec dautres données biochimiques) Mesures en temps réel Classes de taille et abondance cellulaire Marqueurs uniques: - naturels (chlorophylle, autres pigments autofluorescents) - induits (coloration) fluorochromes (sondes) Tri (post-analyses, cultures)

11 Plateforme régionale de cytométrie pour la microbiologie (PRéCyM) du COM (2005) Quest-ce quune plateforme? - Centralisation déquipements et dun savoir faire à disposition des unités/instituts, des domaines public et privé, - Exploitation technique, économique et scientifique optimale des appareils, - Développement et veille technologique, valorisation de la recherche, formation. >> Contacts : et Equipement 2 analyseurs (paillasse) 2 trieurs dont un embarquable1 analyseur in situ

12 Cytosub (Cytobuoy) : un cytomètre en flux dédié à lanalyse autonome et in situ du phytoplancton. Analyse in situ jusquà 200 m. de profondeur Fréquence déchantillonnage maximale toute les 10 min. Durée dimmersion possible de plusieurs semaines

13 - Deux variables dites de diffusion des photons du laser : + Aux petits angles (FWS : forward scatter) Taille des particules. + A 90° (SWS : sideward scatter) Morphologie de la cellule (forme, granularité, paroi cellulaire, composition interne,...). - Trois variables démission de fluorescence (autofluorescence): + Rouge centrée sur nm carotène et chlorophylle a. + Orange centrée sur nm phycobilines (spécifiques aux Cyanobactéries et Cryptophytes) + Jaune centrée sur nm phycoérythrine. - Profil des signaux le long des particules (signature optique du phytoplancton) - Module de prise dimage (module Image in flow) Variables mesurées par le Cytosub

14 Temps Flux Faisceau Laser Chambre en Quartz Fluide Intensité du Signal Acquisition de données

15 Exemples de données

16

17 Exemples de données sur des chaînes

18 De la particule détectée in situ à la cellule identifiée Fluorescence rouge (ua) Taille (ua) …à la particule … De léchantillon naturel … … à la cellule

19 Travaux de thèse de Mélilotus THYSSEN Diversité du phytoplancton étudiée cellule par cellule sur la base de leurs propriétés optiques (diffusion, fluorescence) Analyse in situ = pas de modifications du système étudié Analyse individuelle des cellules = diversité et physiologie Diversité des types cellulaires est variable en fonction des conditions environnementales Notion de groupe fonctionnel de réponse Thyssen et al., 2008a, J. Plank. Res. Fluorescence rouge (u.a.) Diffusion (u.a.) Type cellulaire 2 Phytoplankton spatial and temporal high frequency analysis using automated and submersible flow cytometry Type cellulaire 3 Type cellulaire 1

20 Point fixe côtier Méditerranée. Fréquence danalyse 30 min. Données in situ. Travaux de thèse 2/ Lhétérogénéité temporelle Lobservation à haute fréquence donne une estimation réaliste de la variation de leur biomasse, donc des flux de matière Jours 10 3 cells.cm Jours µg chl a.dm Jours 10 3 cells.cm Biomasse globale (fluorimétrie) Sur- sous estimation liées aux facteurs de conversion C/Chl Si échantillonnage classique: sur ou sous estimation de la variation de la biomasse Exemple de deux types phytoplanctoniques Thyssen et al. 2008b, J. Plankt. Res. 17 h 8 h échantillons! Hétérogénéité en fonction: - du régime de vent, - du rapport N/P

21 Travaux de thèse 3/ Lhétérogénéité spatiale Déconvolution entre cause interne (cycle cellulaire) ou externe (hydrodynamisme) de la variation des abondances Thyssen et al. 2008, Biogeosciences Thyssen et al. 2005, J. Geophy. Res. ajustement des algorithmes de calcul de la biomasse autotrophe á partir des images satellites avec des données in situ de même résolution (1-2 km) Projet ACYPHAR - radiale Açores - Lorient, Atl. Nord Est. Résolution ~2 km. Prélèvement automatisé des eaux de surface par cytométrie en flux Chlorophylle de surface par téledétection Ex. de deux types phytoplanctoniques Denis & Thyssen Quand océanologie et réinsertion sociale se concertent. Journal de lINSU

22 Pour chaque type cellulaire et grâce à lobservation à haute fréquence Temps t cells.cm -3 Taux journalier de croissance et de décroissance apparente Production Nette = Δ Biomasse / Δ t Abondance (Biomasse) Détermination de la production nette grâce à la haute fréquence Estimation adéquate de la variation des stocks de matière particulaire biogène Travaux de thèse 4/ Détermination de la production communautaire nette

23 Nouvelle thèse sur lEtang marin de Berre (Figures David Nérini) Particularités : - Forte stratification haline - Arrivées soudaines et massives deau douce (Centrale EDF) - Vent (Mistral) homogénéisation - Episodes deutrophie (anoxie) - Un des plus grands étangs marins de Méditerranée. - Proche de lagglomération Marseillaise, - Soumis à de fortes pressions dorigine anthropique (rejets deau douce de la centrale EDF, activités industrielles, forte population sur son bassin versant, etc.). Très fort intérêt pour la Région

24 Etang sous haute surveillance + Hydrologie : -Température, - Salinité, - Turbidité, - Oxygène Dissous Données horaires Données horaires 5 niveaux de la colonne deau + Courantologie (XSurvey) + Chimie (Sels nutritifs…) + Météorologie + Biologie : - « gros » phytoplancton - algues et phanérogames - zooplancton - poissons Et les micro-organismes dans tout ça? Station automatique de prélèvements

25 Automatisation du traitement des données issues du Cytosub Problème : Discriminer des groupes sur la base de leur signature optique. Hypothèse : Information discriminante dans la forme que prennent les profils. (Malkassian et al. En préparation)

26 Description (Qui est là? Et quand?): –Caractériser spatialement et temporellement les composantes de lassemblage microbien en relation avec lenvironnement biotique et abiotique - daprès leurs propriétés optiques de diffusion et de fluorescence, -par analyse dimage (automatisée). –Etudier les abondances avant, pendant et après les forçages : –Vent (Mistral) Rupture de la stratification haline –Apport deau de mer (passe de Caronte) Espèces marines –Apport soudain et massif deau douce (Centrale hydroélectrique de Saint-Chamas) Espèces dulçaquicoles Pourquoi ce sujet ? [Intérêt scientifique] Dynamique (Qui varie comment?) - Réponse des assemblages microbiens aux changements environnementaux biotiques et abiotiques (notions de groupes fonctionnels) - Modélisation

27 Conclusion Cytométrie en flux autonome in situ: –Permettra de réaliser un suivi à haute fréquence et à léchelle individuelle des assemblages phytoplanctoniques. –Analyse réalisée grâce a un instrument immergé autonome permet de saffranchir de lopérateur et des sorties en bateau dépendantes de la météorologie –Ce système garantit des séries de données à haute fréquence, et continues (peu ou pas de données manquantes). Appréhender la dynamique de lécosystème suite à une perturbation soudaine (fort vent, apport massif deau douce, rupture de la stratification haline, etc.) Répondre aux questions posées (cas de lEtang de Berre par exemple) Finalité de lapproche : le domaine marin côtier et ouvert (stations fixes et navires dopportunité (Méthaniers? Ferries? Portes-conteneurs?) - Etendre lapproche aux « bactéries » (AO INSU-CSOA & CETSM) Observation = Constitution dune base de données unique sur le phytoplancton en Mer Méditerranée

28 Léquipe Michel DENIS (DR émérite CNRS) Mélilotus THYSSEN (Post-doctorante) Anthony MALKASSIAN (Doctorant 2009) Zhao LI (Doctorante 2009) Ainsi que : Aude BARANI (plate-forme PRECYM) Beatriz BECKER (identification du phytoplanton) Nicole GARCIA (analyses sels nutritifs) David NERINI (MCF, Statistiques) Patrick RAIMBAULT (SO du COM)


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