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Etude histologique, cellulaire et moléculaire de la régénération.

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1 Etude histologique, cellulaire et moléculaire de la régénération

2 colonnes

3 Correction Elucidation du protocole cellule normale cellules C2C12 (avec ou sans Flag) protéine Msx1 cellule musculaire différenciée gène Msx1 Ac anti-Msx1 gène Flag Ac anti-Flag Flag-Msx1

4 avant IP : colonne 1 (cellules exprimant seulement Msx1) : protéines présentes dans le noyau = histone H1, histone H3, Pol II, Msx1 colonne 2 (cellules exprimant Flag-Msx1) : mêmes protéines + Flag après IP : colonne 3 : aucun spot car immunoprécipitation des seules protéines Flag-Msx1 colonne 4 : Anti-H1 : présence dun spot = détection de H1 par les Ac anti-H1 Flag-Msx1Ac anti-H1 H1

5 Anti-H3 : absence de spot = absence de détection de H3 par les Ac anti-H3 (marquage de H3 seulement si liaison à Msx1) Anti-Pol II : absence de spot = absence de détection de Pol II par les Ac anti-Pol II Anti-Flag et Anti-Msx1 : présence de spots = détection normale de Flag-Msx1 par les Ac anti-Flag et les Ac anti-Msx1 Msx1 se lie seulement à la protéine histone H1 mais ni à la protéine histone H3 ni à la Pol II : la liaison entre Msx1 et H1 semble H3 libre Flag-Msx1 Ac anti-H3 (mis en présence de Flag-Msx1 exclusivement) spécifique

6 suivant :

7

8 Correction Msx1 entière (contrôle) ou avec délétions 1-42, 1-73 ou : résultats identiques = pas deffets des délétions situées en amont de lacide aminé 105 sur la liaison de Msx1 sur lADN délétion : suppression de la répression transcriptionnelle de MyoD, de linhibition de la différenciation, de linteraction avec H1 et de la liaison au CER région nécessaire au rôle de Msx1 et à tous ses effets cellulaires = nécessité de lintégrité de la région délétion de lhoméodomaine et la partie en aval de celui-ci : effets identiques à la délétion malgré le maintien de la région essentielle la région est nécessaire mais pas suffisante pour permettre à Msx1 dassurer son rôle

9 Msx1-A (séquence des acides aminés de lhoméodomaine modifiée) : suppression de la répression transcriptionnelle de MyoD, de linhibition de la différenciation et de la liaison au CER mais maintien de linteraction avec H1 interaction entre Msx1 et H1 nécessaire mais pas suffisante pour la liaison au CER, la répression transcriptionnelle de MyoD et linhibition de la différenciation 2 domaines de Msx1 sont nécessaires à la liaison de Msx1 à lADN : - la région qui permet la liaison au CER - lhoméodomaine qui lie lADN grâce à lhistone H1

10

11 colonnes

12 Correction document A, pré-requis : lhistone H1 est nécessaire à linhibition de la différenciation des cellules musculaires colonnes 3 et 6 : lARNi H1 inhibe lexpression de H1 de 50% ; la diminution de la quantité de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation des cellules musculaires colonne 6 : la coexpression de Msx1 et de lARNi H1 entraîne une réduction de la production de H1 et donc une réduction de linhibition de la différenciation des cellules musculaires alors que… colonne 5 : … la coexpression de Msx1 et de lARNi contrôle ne conduit à aucune diminution de la production de H1, ce qui permet la normale différenciation des cellules musculaires…

13 … ainsi, lARNi contrôle ninterfère en rien dans les mécanismes de contrôle de la différenciation des cellules musculaires Msx1 nécessite la présence de lhistone H1 pour inhiber la différenciation des cellules musculaires

14 document B, pré-requis : MHC, chaîne lourde de la myosine, est un marqueur de la différenciation colonne 3, construction Flag-Msx1 : absence de MHC = absence de différenciation (vérification du rôle inhibiteur de Msx1 sur la différenciation des cellules musculaires) colonne 5, construction ARNi H1 : présence de MHC = différenciation cellulaire labsence (ou la diminution de quantité) de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation cellulaire colonne 6, construction Flag-Msx1 + ARNi contrôle : absence de MHC = absence de différenciation cellulaire Msx inhibe la différenciation car… colonne 4, … construction ARNi contrôle : présence de MHC = différenciation cellulaire pas deffet propre de lARNi

15 colonne 7, construction Flag-Msx1 + ARNi H1 : présence de MHC = différenciation cellulaire la suppression (ou la diminution de la quantité) de H1 supprime la capacité de Msx1 à inhiber la différenciation des cellules musculaires Msx1 nécessite la présence de lhistone H1 pour inhiber la différenciation des cellules musculaires


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