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INSERM – Université Pierre et Marie Curie Pitié-Salpêtrière « Génétique et mécanismes des maladies de lexcitabilité musculaire et de la sclérose en plaques»

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Présentation au sujet: "INSERM – Université Pierre et Marie Curie Pitié-Salpêtrière « Génétique et mécanismes des maladies de lexcitabilité musculaire et de la sclérose en plaques»"— Transcription de la présentation:

1 INSERM – Université Pierre et Marie Curie Pitié-Salpêtrière « Génétique et mécanismes des maladies de lexcitabilité musculaire et de la sclérose en plaques» Dr Sophie NICOLE GENETIQUE ET HEMIPLEGIE ALTERNANTE

2 Génétique et hémiplégie alternante? Très probablement car : signes cliniques stéréotypés pas de lien avec un facteur particulier (grossesse, environnement,…) cas familiaux (jumeaux monozygotes) hémiplégie alternante liée à une mutation ATP1A2, SLC1A3 et CACNA1A

3 Un corps humain est composé dorganes Corps, organes, cellules et chromosomes 23 paires de chromosome Une cellule contient 23 paires de chromosomes Chaque organe est composé de cellules ( 1 péta (10 15 ) cellules dans le corps humain)

4 Chromosomes, gènes et bases : ADN Lensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de bases Les chromosomes contiennent des gènes Lensemble des chromosomes humains contiendrait gènes Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide DéoxyriboNucléique)

5 Chromosomes, gènes et bases : ADN Lensemble des chromosomes est composé de 3,2 milliards de paires de bases Les chromosomes contiennent des gènes Lensemble des chromosomes humains contiendrait gènes Les chromosomes sont composés de paires de bases ou ADN (Acide DéoxyriboNucléique) BASE GENE CHROMOSOME lettre phraselivre

6 Gènes et protéines Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirs chromosome Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirs gène la maitresse nous donne beaucoup trop de devoirs exons LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAUCOUP TROP DE DEVOIRS protéine Fonction cellulaire La protéine exerce une fonction cellulaire Un gène code pour une protéine

7 Gènes, protéines et cellules

8 Protéines et maladies Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à lorigine dune maladie LA MAITRESSE NOUS DONNE BEAU DE DEVOIRS protéine Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirs chromosome muté Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedcdemlkjhgdevoirs gène la maitresse nous donne beau de devoirs exons Lanomalie dans la protéine résulte dune mutation dans le gène Lamaazertyuioqsdfghjklmaitresswxcvbnenousdonnebeauaqwzsxedccouptropdemlkjhgdevoirs chromosome

9 Protéines et maladies Une protéine anormale (mutée) ou absente peut être à lorigine dune maladie Lanomalie dans la protéine résulte dune mutation dans le gène trouver lanomalie parmi 3,2 milliards de lettres

10 Comment identifier lanomalie génétique? Banque dADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage) - lassociation française contre les myopathies : euros - lAFHA : euros débutée en juin Au 30 octobre : - 22 familles - 72 personnes données cliniques essentielles - médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE

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12 Comment identifier lanomalie génétique? Banque dADN pérenne des patients et famille proche financement (envoi sang, préparation ADN et cellules, stockage) - lassociation française contre les myopathies : euros - lAFHA : euros débutée en juin Au 30 octobre : - 22 familles - 72 personnes conseil scientifique en cours détablissement - banque (1) - AFHA (1) - neuropédiatre et chercheur (2-3) Ouverte à tout projet de génétique sur lHA données cliniques essentielles - médecin suivant le patient : FICHE FAMILIALE - base de données européenne ENRAH

13 Comment identifier lanomalie génétique? Mode de transmission : dominant de novo possible Banque dADN pérenne des patients et famille proche dominant de novo dominant Etudes moléculaires de lADN des patients comparés à des individus « témoins »

14 Etudes moléculaires de lADN I.Approche gènes candidats: Idée sur la fonction cellulaire altérée Migraine hémiplégique familiale - gènes ATP1A2, CACNA1A - faite par les équipes américaines, hollandaises et italiennes Pas de mutation dans les cas d hémiplégie alternante « typique » Nombre gènes candidats trop important pour poursuivre cette approche

15 Etudes moléculaires de lADN II. Approche génomique : rechercher lanomalie dans la totalité du génome - anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») - 1 patient aux USA: rien de trouvé - 1 patient allemand, qui devrait être étudié (Pays-Bas) - oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région

16 Etudes moléculaires de lADN II. Approche génomique : rechercher lanomalie dans le génome entier - recherche danomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays) Plateforme Illumina « P3S » - anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») - oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région

17 Etudes moléculaires de lADN II. Approche génomique : rechercher lanomalie dans le génome entier sonde ADN à tester - recherche danomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays) - anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») - oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région

18 Etudes moléculaires de lADN II. Approche génomique : rechercher lanomalie dans le génome entier ADN contrôle (parents) ADN enfant - recherche danomalies submicroscopiques sur les chromosomes (CGH ou SNP arrays) - anomalies microscopiques sur les chromosomes (« caryotype ») - oriente les recherches sur une région chromosomique et les gènes présents dans cette région

19 II. Approche génomique : rechercher lanomalie dans le génome entier avantages : - manipulation rapide - pas da priori biologique désavantages : - chère car nouvelle technologie -support informatique faites aux Etats-Unis (K. Svoboda)? Etudes moléculaires de lADN

20 Projet de recherche Recherche danomalies submicroscopiques par SNP-CGH arrays (Illumina) - Janvier - septembre 2009 Analyse de 100 patients européens (idéal) euros par patient : euros - analyses informatiques - réalisée par Chirine El Baba (étudiante M2 : BAC + 5 ans) - Septembre juin 2010 Validation des remaniements candidats - SNP-CGH arrays chez les parents si plus de 20 remaniements / patient euros (estimation 20 patients) - quantitative real-time PCR euros (estimation 50 remaniements) - rémunération dun doctorant (3 ans)coût patronale de euros/mois soit euros / an - Total coût à euros

21 Futur… - Remaniements pathologiques candidats : - études des gènes de la région - recherche de mutation chez les patients sans remaniements - Pas de remaniements pathologiques candidats : - recherche de modifications épigénétiques envisagée en Belgique? - séquençage génome complet de plus en plus envisageable…

22 Prof Bertrand Fontaine Chirine El Baba

23 Immunomarquage PLN sur fibroblastes humains Culture de fibroblastes - ensemencement à cellules par puit (100 µl maximum/puit) 2 boites et 2 puits/boite par individu (3 puits pour le témoin) - après ½ journée, rajouter 1 ml de milieu/boite (milieu + 10% SVF) - laisser pousser de 4 ( ) à 6 ( ) jours (jusquà ce que cellules soient confluentes) Immunomarquage - rinçage PBS 1X - fixation PFA4% froid, 10 min à 4°C - rinçage 3X PBS1X - rapide rinçage PBS-tween 0.1% - incubation anticorps primaire. 1H00, T° ambiante 1 série avec triton : PBS-BSA3% + triton-X % 1 série sans triton : PBS-BSA3% - anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab.) + anti-fibronectine (1/500 ; F3648, Sigma-Aldrich) - anti-DIII (1/50 ; clone 7B5, Zymed lab) + anti-DV (1/100; R. Timpl, lapin). - 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante - incubation anticorps secondaire. 1H00, T° ambiante (PBS-BSA3%) - anti-souris FITC (1/100 ; whole IgG, Jackson immunoresearch) + anti-lapin-TR (1/100, Jackson Lab) - 3 X 5min rinçages PBS-tween 0.1%, T° ambiante - 5 min Hoechst 1/100 dans PBS1X - rinçage 1X PBS1X - rapide rinçage H2O et montage fluoromount-G (Southern Biotechnology). ! pas de montage en vectashield car cellules se décollent.

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26 Coût estimé Euros HTEchantillon20 familles (60 ech.) Illumina (P3S) lames CNV610-Quad 300 échantillon2 run1,5 Affymetrix (Strasbourg) sonde 345 lames SNP Agilent (Strasbourg) sonde 345 lames 1 X 244K478 (X 2?)


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