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Master 1 neuroscience Eléonore SERANO Romain TERROCHAIRE.

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1 Master 1 neuroscience Eléonore SERANO Romain TERROCHAIRE

2 Introduction: La coloration des neurones morts est utilisée depuis plus de 100 ans, avec l'invention de la coloration de Golgi qui a permis la première description de réseaux de neurones (rendus visibles par du chromate d'argent sur tissus morts) Transport antérograde identification des efférences Transport rétrograde identification des cellules cibles dune ou plusieurs cellules du SNC. Marqueurs fluorescents les plus utilisés: - PI - NY - RITC - FB En 1986, introduction des marqueurs de carbocyanine: DiO, DiI (marqueur post- mortem)

3 I. Méthodes et Généralités Injection sous pression. - FB, DY, dextrans aminés sont solubles - carbocyanines nécessitent un solvant organique Injection iontophorétique. Cristaux de colorants (dye crystals) A. Injection:

4 I. Méthodes et Généralités Absorption active. - dextrans aminés pour des axones lésées - PI, FB pour des terminaisons intactes Absorption passive Injection intracellulaire Transport et séquestration dans la cellule: - Transport actif vésiculaire - Diffusion latéral dans la membrane B. Absorption

5 I. Méthodes et Généralités Pour des marqueurs fluorescents: - Directement visibles - Possibilité dutiliser plusieurs marqueurs en même temps - Pas préservés sur coupe au cryostat ou paraffine - Une trop forte fluorescence peut masquer de plus petits processus Pour des marqueurs non fluorescents: - anticorps spécifiques C. Détection

6 II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs rétrogrades : Transport antérograde Transport rétrograde Le marqueur va être absorbé aux niveau des terminaisons nerveuses et transféré vers le soma du neurone Utilisé lors de létude de la dégénération des axones projetant vers la région du cerveau qui a été détruite Les traceurs antérogrades : Le marqueur est injecté au niveau du soma et sera transporté jusqaux terminaisons nerveuses Cela permet le traçage de cibles anatomiques dune population particulière de projection de neurones

7 II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement antérogrades Les acides aminés radiomarqués : acides aminés tritiés, précurseur métabolique, neuro-transmetteur ou intermédiaire autoradiographie Facilement transporté par des peptides nouvellement synthétisés Faible poids moléculaire Propriétés hydrophiles qui limitent la diffusion à lintérieur de la matrice extracellulaire Sélectivité restreinte pour certaines cellules ou projections

8 II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement antérogrades Les dextrans aminés: Facilement utilisable, injection par pression ou par iontophorèse Grandes variétés de méthodes de détections ont été développées pour eux Peuvent se conjuguer avec de nombreux colorants fluorescents Visibilité immédiate et production de préparation permanente Ex : Fluoro-Ruby, Fluoro- Emerald, Biotinylated dextran amines

9 II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement rétrogrades HRP (Horse radish peroxydase ou péroxydase de raifort) : révélé par la DAB (diaminobenzidine) Lutilisation de trop grandes quantités de traceur peut compromettre la précision de la visualisation 1 er traceur neuroanatomique rétrograde utilisé La coloration est incomplète et reste limitée au soma et aux dendrites primaires Analyse de lultrastructure Détection profite des propriétés enzymatique du traceur (DAB et TMB) Labsorption par les terminaisons nerveuses se fait par des vésicules qui contiennent lenzyme

10 II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs exclusivement rétrogrades Fluoro-gold, E. Coli enterotoxin subunit B, billes microsphériques fluorescentes en latex Marquage sur du long terme Temps de survie 24h à 48h Étiquetage pendant plusieurs mois

11 II. Les traceurs monosynaptiques Les traceurs antérogrades et rétrogrades Les colorants de carbocyanides (DiI, DiO, DiAsp, DiA) Les toxines bactériennes (sous-unités b de la toxine du choléra) Utilisation in vivo ou in vitro Fluorescence intense des voies de signalisation Fort pouvoir lipophile Diffusion axonale lente Se lie aux gangliosides présent sur la surface neuronale Marque de grands réseaux neuronaux Les lectines (WGA, PHA-L) Forte affinité pour de nombreux sucres transport spécifique efficace

12 II. Les traceurs monosynaptiques Les marqueurs fluorescents (TRITC, FITC, FB, TB, rhodamine …) La biocytine et neurobiotine Simple à utiliser Forte sensibilité pour le traçage Combinaison possible avec dautres méthodes de traçage Non dégradé avec le temps Marquage très fin des arborisations axonales Faible poids moléculaire Forte affinité pour lavidine (détection)

13 III. Les traceurs transsynaptiques Traceurs permettant la visualisation dun réseau neuronal traceurs pouvant passer les barrières synaptiques présentes entre les neurones Virus neurotropes modifiés (Herpès, rhabdovirus) WGA-HRP Fragment C de la toxine tétanique Lectines, fucose radioactif, … Les plus utilisés Dépend des conditions expérimentales Transport transneuronal de la périphérie Diminution du signal dans le neurone de 2 nd ordre, …

14 III. Les traceurs transsynaptiques Les virus neurotropes : Réplication dans les cellules hôtes après le transport neuronal Transport de la périphérie jusquau système nerveux central Amplification du signal Détection des antigènes viraux dans le corps des cellules neuronales avec immunocytochimie

15 Conclusion De nos jours nous possédons une palette de marqueurs Ils sont soit antérogrades, soit rétrogrades ou les deux Ils ont donc des applications différentes La recherche de marqueur se poursuit ex: WGA-HRP transgène

16 Merci de votre attention !


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