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Directeur de Thèse: Dr. Sabine CARPIN, LBLGC Université dOrléans Co-encadrement: Dr. Audrey OUDIN, BBV Université de Tours Identification et caractérisation.

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1 Directeur de Thèse: Dr. Sabine CARPIN, LBLGC Université dOrléans Co-encadrement: Dr. Audrey OUDIN, BBV Université de Tours Identification et caractérisation de facteurs de transcriptions appartenant à la famille des régulateurs de réponse de type B, impliqués dans la réponse à la sécheresse chez le peuplier Laboratoire de Biologie des Ligneux et des Grandes Cultures - UPRES EA 1207 par Inès DJEGHDIR

2 Problématique de léquipe daccueil du LBLGC Equipe ARCHE 3 équipes dont léquipe ARCHE: Arbres et Réponses aux Contraintes Hydriques et Environnementales Réponse des arbres aux contraintes environnementales: Différentes approches: Ecophysiologique Épigénétique Protéomique Signalisation Voie commune aux végétaux et aux levure: Phosphorelais Multiple sécheresse peuplier

3 Le phosphorelais multiple 3 partenaires: Récepteur ou Histidine-aspartate Kinase : HK Protéines de relais de phosphate ou Histidine Phosphotransfer protein : HPt Régulateurs de Réponse : RR RR HPt N C

4 Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp. 10 HPt 12 RR-B Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013 Paroi cellulaire Membrane plasmique Noyau N C HK1 N C N C N C Cytokinines 1 HK2 2 HK3 2 HK4 N C H D N H C D Contrainte osmotique

5 Partenaires du phosphorelais multiple chez Populus sp. RR-B Paroi cellulaire Membrane plasmique Noyau Contrainte osmotique N C HK1 N C N C N C P P Chefdor et al., 2006, Bertheau et al., 2012, Héricourt et al., 2013 HPt P

6 Etat de lArt au laboratoire HK1 analogue de AHK1 dArabidopsis (Chefdor et al., 2006) Récepteur HK1 isolé = osmosenseur potentiel (Chefdor et al., 2006) capable de dimériser (Héricourt et al., 2013) AHK1 N C HK1 N C 65% didentité 82% de similarités

7 Etat de lArt au laboratoire 3 HPt sont les partenaires préférentiels de HK1 (Héricourt et al., 2013) HPt 2, 7 et 9 sont les HPt majoritairement impliquées dans losmosensing

8 Etat de lArt au laboratoire Les 8 RR-B isolés interagissent avec les 3 HPt précédentes (Bertheau et al., 2012) Ces RR sont-ils fonctionnels chez le Peuplier?

9 Stage de Master II Choix du RR13 : Homologue Arabidopsis : rôle prépondérant dans le développement de la plante Chez Peuplier : RR le plus fortement exprimé et présentant de fortes interactions avec les 3 HPt partenaires de HK1 (Bertheau et al., 2012) importance probable de ce RR Stratégie de recherche: Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur lADN Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte osmotique: HK1 et dhn1 Caractériser la régulation de lexpression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique

10 Stage de Master II Stratégie de recherche: Evaluer la fonctionnalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur lADN C C N N Domaine receveur : Motif DDK Domaine GARP, fixation à lADN : reconnaissance de boites spécifiques chez Arabidopsis (Sakai et al., 2000 ; Sakai et al., 2001) Domaine de transactivation

11 Evaluer la fonctionalité du RR13 Fixation du GARP-RR13 sur lADN AV0 + - AV0 GST-GARP : + - ERF + - ERF + - Fixation spécifique sur les sondes AVO et AV2 possédant des boites spécifiques

12 Evaluer la fonctionalité du RR13 Activation de la transcription de gènes régulés par la contrainte osmotique: HK1 et dhn1 Test de transactivation dun gène de RRA Arabidopsis (ARR6) par fixation du RR13 sur son promoteur (ARR2 (RR-B) d Arabidopsis utilisés en contrôle) Augmentation de lactivité du promoteur ARR6 avec le même niveau defficacité que le contrôle positif (ARR2) Le RR13 est un facteur de transcription fonctionnel ** Luc ARR2 RR13 Promoteur ARR6

13 Caractériser la régulation de lexpression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique Diminution de la conductance stomatique = fermeture des stomates, perception de la contrainte et mise en place dune réponse

14 Caractériser la régulation de lexpression des gènes RR13, HK1, dhn1 lors de la contrainte osmotique T0T5T10T20T40T60T120T180T ,5 1 1,5 2 2,5 Expression de HK1 dans les feuilles au cours du temps ** *** * ** T0T5T10T20T40T60T120T180T360 Expression de HK1 dans les racines au cours du temps T0T5T10T20T40T60T120T180T360 Expression du RR13 dans les racines au cours du temps ** * *** ** *** * ** T0T5T5T10T20T40T60T120T180T360 * *** * * Expression du RR13 dans les feuilles au cours du temps

15 Objectifs : 1. Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique 2. Caractérisation de lactivité transcriptionnelle des RR de type B candidats 3. Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels Projet de recherche

16 Identification des RR de type B spécifiquement impliqués dans la réponse à la contrainte hydrique Technique: qPCR sur les 8 RR-B sur des échantillons stressés Projet de recherche

17 Caractérisation de lactivité transcriptionnelle des RR de type B candidats Techniques: - Gel retard ou EMSA - Délétion de promoteurs et mutagénèse des boites de fixation Projet de recherche + GARP ?

18 Identification des partenaires des RR de type B pouvant constituer ensemble des complexes transcriptionnels Techniques: Double hybride après criblage de banque ou interaction ciblée Projet de recherche 12

19 Merci de votre attention

20 Le phosphorelais de levure cytoplasme Membrane plasmique N C H D SLN1 YPD1 SSK1 P Condition témoin P P Voie HOG inactive

21 Le phosphorelais de levure cytoplasme Membrane plasmique N C H D SLN1 YPD1 SSK1 Osmolarité forte Voie HOG HOG1 P activé SSK2 P

22 Transformation par biolistique RR S ARR- 2 35S GUS UBIARR6 Contrôle internePromoteur ARR6 RR B + + ou Contrôle positif Condition test

23 Exemple de gènes régulés lors de la contrainte hydrique Enzymes de détoxication et composés anti-oxydants : - SOD (SuperOxyde Dismutase), CAT (CATalase), GPx (Gluthatione PeroXydase) - acide ascorbique, glutathion … Osmoprotectants: - certains acides aminés : proline - des dérivés dacides aminés : glycine - des sucres et des polyols : raffinose, mannitol… Aquaporines : protéines membranaires formant un pore permettant le passage de leau et dautres solutés HSP et chaperonnes: - HSP 70, … - chaperonines Implication majeure dans la renaturation ou la dégradation des protéines agrégées lors des stress

24 Les Dehydrines Définition: - famille LEA (Late Embryogenesis Abundant proteins) - accumulation dans les plantes durant les étapes tardives de lembryogenèse ou en réponse au stress environnementaux. Structure: - présence ou absence dun segment Y - segment S: Présence ou absence dun domaine à Sérines phosphorylables - segment K : hélice(s) alfa - segments φ: riche en glycine ou acides aminés polaires Absence de résidus cystéine ou tryptophane

25 Propriétés: - 5 sous groupes de déhydrines : YnSK2, SKn, KnS, Y2Kn et Kn - solubilités en solution aqueuse à 100°C - localisation cytoplasmique, mitochondriale ou nucléaire - protéines hydrophiles mais contenant une hélice alpha amphiphiles liant les lipides. fixation possible aux lipides membranaires de petites vésicules - gènes inductibles par différents types de stress abiotiques Les Dehydrines

26 Rôles probables : - stabilisation des structures endomembranaires lors de stress abiotiques segments K -rôle de protection contre les radicaux libres par certaines déhydrines - rôle de protection lors de la déshydratation des graines. Les Dehydrines

27 Les Aquaporines protéines membranaires de 25 à 30kDa présentes dans tout les organismes du monde vivant (35 chez Arabidopsis, 31 chez Zea mays) et dont certaines sont constitutives plusieurs sous familles 6 domaines transmembranaires et 2 extrémités cytoplasmiques identiques 2 à 2 peptide caractéristique : NPA formant un canal à eau grande conservation des acides aminés formant le pore aqueux formation de tétramères où chaque monomère est un canal à eau certaines sont eau spécifique, glycérol spécifique et dautres sont mixtes N P A N P A H2NH2N HOOC S S S Canal à eau Domaines de phosphorylation cytoplasme Apoplasme ou vacuole

28 Les Aquaporines régulation du flux deau via leur phosphorylation par une protéine kinase calcium dépendante membranaire expression fortement corrélée aux cellules associées au flux deau certains gènes peuvent être soit sur, soit sous-exprimés par la sécheresse la méthylation peut les réguler

29 Le PolyEthylène Glycol

30 Phosphorylation de lHistidine

31 Phosphorylation de lAspartate

32 Formules dautres acides aminés Arginine Lysine Sérine Thréonine

33 Technique du double hybride (Y2H) Mating entre levures appât et proie Levures diploïdes Interaction entre les deux protéines Activation de 2 gènes rapporteurs Sélection diploïdes Dosage β-Gal Activation HIS3 Activation LacZ

34 Autre stage au LBLGC (L. Baquet M1 ) Chez Arabidopsis : Récepteur osmosensing : AHK1 Récepteurs CK : AHK2, AHK3, AHK4 Protéines relais : HPt1 à HPt5 Interconnexion par HPt communes entre voie CK et voie osmosensing Chez le peuplier : Récepteurs osmosensing : HK1a, HK1b Récepteurs CK : HK2, HK3a, HK3b, HK4a, HK4b Protéines relais : HPt1 à HPt10 Quels sont les HPt communes et/ou distinctes entre la voie CK et la voie osmosensing chez le peuplier ?

35 Tableau récapitulatif de lensemble des résultats 4 groupes Interaction forte avec une seule HK Interaction forte avec plusieurs HK Interaction faible avec plusieurs HK Peu ou pas dinteraction avec les HK HPt1HPt2HPt3HPt4HPt5HPt6HPt7HPt8HPt9HPt10 HK1a+/-++++/ HK1b /- HK2-+/ HK3a-++/ HK3b / /- HK4a-+/ HK4b-++/

36 HPt7 partenaire préférentiel de HK1a. Partenaire spécifique de la voie osmosensing ? HPt1 et 3 partenaires préférentiels de HK3b. Partenaires spécifiques de la voie CK ? HPt2, 6, 9 partenaires communs à des HK des 2 voies. Points dinterconnexion entre les 2 voies ? Tableau récapitulatif de lensemble des résultats

37 Résultats : Vue densemble des 66 interactions testées Peu dactivation des gènes rapporteurs Intensité variable, HK3b étant le plus fort HK1bHK2HK3aHK3bHK4aHK4b + pGAD- HPt2 + pGAD- HPt1 + pGAD- HPt3 + pGAD- HPt4 + pGAD + pGAD- HPt5 + pGAD- HPt7 + pGAD- HPt6 + pGAD- HPt8 + pGAD- HPt9 + pGAD- HPt10 pLex-HK

38 Activation des 2 gènes rapporteurs HPt 1, 2, 3, 5, 6, 9, 10 Absence dactivation des gènes rapporteurs HPt 4, 7, 8 + pGAD- HPt2 + pGAD- HPt1 + pGAD- HPt3 + pGAD- HPt4 + pGAD + pGAD- HPt5 + pGAD- HPt7 + pGAD- HPt6 + pGAD- HPt8 + pGAD- HPt9 + pGAD- HPt10 pLex-HK3b Résultats : Détail pour HK3b

39 Résultats : Dosage β-Gal pour HK3b Différences de force dactivation du gène LacZ HPt2 > HPt9 > HPt6 > HPt3 > HPt1 ** Les valeurs correspondent aux moyennes de 6 essais indépendants en tripliquat. ** pour p<0.01. Les barres derreurs standard sont affichées.


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