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Benoît Schubert Biologie de la Reproduction Autoconservation des gamètes Pr Catherine Poirot Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière.

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1 Benoît Schubert Biologie de la Reproduction Autoconservation des gamètes Pr Catherine Poirot Assistance Publique-Hôpitaux de Paris Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière

2 AUTOCONSERVATION Gamètes matures Spermatozoïdes Ovocytes Tissus gonadiques Ovaire Testicule

3 Préserver la fertilité chez lhomme

4 Historique Spallanzani Cryoprotecteur/ glycérol Grossesse avec sperme congelé CECOS en France (G. David) et - Centres dAMP intra conjugale

5 Techniques Milieux de congélation Glycérol Agent cryoprotecteur pénétrant Toxique pour la cellule Contact à basse température Durée de contact limitée Ajout en 4 étapes (moins délétère quen 1 fois) Mise en paillettes Extrémités soudés

6 Techniques Congélation cristallisation de leau extra-cellulaire Concentration relative des solutés augmente Déshydratation du spermatozoïde Décongélation Retrait du CP en plusieurs étapes Concentration relative des solutés diminue (milieu hypo-osmotique) Entrée deau dans le spermatozoïde Puis sortie du Glycérol Retour à un volume cellulaire normal

7 Techniques Congélation lente: en azote liquide manuelle Vapeurs dazote : 8-30 minutes Plonge dans azote liquide Appareils programmables Descente en température contrôlée 5°C/minute - 10°C 10°C/minute - 25°C 25°C/minute - 150°C Décongélation rapide -196°C 37°C (en qq minutes)

8 Effets de la congélation sur les spermatozoïdes Mobilité : variable, environ 50% Vitalité : variable, environ 50% Membrane : Gonflements Membrane plasmique Gonflement acrosome perte acrosome Modification de la composition phospholipidique Noyau Chromosomes: pas de modification nb, structure, sex ratio Etat de sur-condensation de la chromatine

9 I NDICATIONS TRAITEMENTS A RISQUES Chirurgie à risque Pathologies à risque Vasectomie Dégradation caract. spermatiques Situation à risque … Cryptozoospermie Spz chirurgicaux Spz médicaux Spz après chirurgie Spz contexte viral … PREVENTIONAMP Lautoconservation doit être « systématiquement proposée » avant une « thérapeutique ou intervention potentiellement stérilisante » Et peut être proposée « avant ou au cours dune AMP » Arrêté du 12/1/1999

10 Avant Traitement (27182) Avant vasectomie (7904) AMP (9618) Spz chirurgicaux (2662) FEDERATION DES CECOS : 30 ans dautoconservation

11 FEDERATION DES CECOS : autoconservation maladie

12 Pourcentage dhommes pour lequel la congélation a pu être réalisée Avant traitement Avant vasectomie % 91% 97% 65% 92%

13 Patient Information autoconservation Accueil du patient personnalisé Consultation avec médecin biologiste Méthodes Masturbation Recherche spermatozoïdes dans les urines Urgence du traitement : permanence de laccueil Information des résultats de la congélation « Le patient doit être informé de la qualité du sperme et du nombre de paillettes »Arrêté du 12/1/1999

14 Techniques : rares spermatozoïdes Mise en paillettes classiques haute sécurité Micro-gouttes Guthauser et al., Andrologie 2002 Intérêts : augmenter le nombre de « doses », faciliter la recherche des spermatozoïdes prêts à lemploi SPZ

15 Sécurité Identité Traçabilité Consentement Interrogation annuelle Renouvelable sur demande écrite Utilisation Résultats Destruction « Seul le déposant peut demander la restitution ou la destruction » Sérologies HIV, VHB, VHC, Syphilis Paillette haute sécurité Cuve de quarantaine Cuves spécifiques Accès locaux Sécurité azote PatientGénérale

16 Problèmes Age Limites supérieures Limites inférieures Puberté, possibilités de masturbation Maladie de lhomme Urgence Etat du patient Indications autres Vasectomies Professions Sportifs Information Patients et médecins

17 Perspectives Optimisation des méthodes de congélation Tissu gonadiques Meilleure information sur lautoconservation …. Lyophilisation du spermatozoïde !!! Wakayama T. Yanagimachi R., Nature Biotechnology 1998

18 Préserver la fertilité chez le garçon prépubère

19 Introduction Enfant : préservation de la fertilité A partir de ans : spermatozoïdes Avant ans Pas de spermatozoïdes éjaculés Cellules souches germinales mâles : spermatogonies Testicule Spermatogonies Pool de réserve : régénération spermatozoïdes : à partir de la puberté Préserver la fertilité : spermatogonies

20 Stratégie de Préservation de la Fertilité des garçons prépubères Avant le début du traitement stérilisant Prélèvement de spermatogonies Conservation spermatogonies : congélation Après guérison Greffe Culture Xénogreffe ? Recherche

21 Préserver la fertilité des garçons : Espoirs Geens et al., 2008

22 Questions Quel volume de tissu à prélever ? Un testicule entier Fragments de testicule Quel tissu conserver ? Fragments de tissu Suspension cellulaire Quel protocole de congélation ?

23 Questions Contamination cellules malignes Tri cellules malignes/testiculaires 0,4% cellules malignes Seuil inconnu chez lhomme Contenu en spermatogonies Faible : 3/ cellules germinales (souris) Enrichissement ? Effets des traitements sur le testicule

24 Utilisation Tissu FRAIS : Allogreffe Injection spermatogonies dans tubules séminifères, rete testis, canaux efférents, … Production de spermatozoïdes Chez différentes espèces dont primates Résultats chez la souris Production de spermatozoïdes Naissances Xénogreffe Tissu humain prépubère frais souris nude (s/c) 4 et 9 mois après greffe : « qq spermatogonies survivantes » (Goossens et al., 2008)

25 Utilisation Tissu CONGELE Survie cellulaire (souris, lapin, humain, …) Xénogreffe sous cutané production de spz (souris) Survie spermatogonies (humain) Culture Souris Multiplication des spermatogonies obtention de spermatozoïdes Peu de résultats dans dautres espèces

26 Autoconservations Spermatogonies Radford et al., 1999 : 11 hommes Bahadur et al., 2000 : 2 garçons (8 et 13 ans) Keros et al., 2005 : 16 hommes Kvist et al., 2006 : 8 garçons (1 à 5 ans 1/2) Keros et al., 2007 : 5 garçons (2 à 14 ans) France : 3 centres (+ 20 patients)

27 En pratique Préservation de la fertilité chez jeune garçon Conservation de cellules souches spermatogonies Utilisation A déterminer Dans 20 ans

28 En pratique Indications Multidisciplinarité Consentements (parents) Technique expérimentale

29 Préserver la fertilité chez la femme

30 Mise en péril du stock folliculaire Stock de follicules : Pas de renouvellement (intra-utérin) (naissance) 0, (puberté) …… 99% des follicules : atrésie Temps Chimiothérapie (Alkylants+++) / Radiothérapie Greffe médullaire : chimio+radio ménopause 92% des cas (Meirow et al., 2001) Pathologies malignes : Femmes : K sein, K invasifs du col, leucémies, … Enfance : leucémie, neurob., LH, ostéosarc., sarc.d'Ewing, LNH Ovariectomie totale ou partielle : Endométriose, kystes bénins récurrents, tumeur Ménopause précoce prévisible : X (Turner, délétion, inversion), génétiques, …

31 Préserver la fertilité féminine aujourd'hui Sans gamètes de la patiente : Don ovocytes Accueil d'embryons Adoption Avec gamètes de la patiente : Transposition ovarienne Traitement aux analogues du GnRH Congélation d'ovocytes : matures ou immatures FIV embryons, congelés transférés après guérison Cryoconservation du tissu ovarien Combiner plusieurs solutions

32 CONGELATION DOVOCYTES

33 Congélation dovocytes Stimulation de lovulation : temps, traitement hormonal Pas de conjoint pas de désir denfants immédiat Ovocyte : cellule particulière, différente de lembryon volumineux cytoplasme membrane plasmique protocole de congélation particulier Congélation lente Vitrification Effets de la congélation/décongélation: Dégranulation prématurée des granules corticaux durcissement de la Z.P. Dépolymérisation du réseau de tubuline du fuseau méiotique et repolymérisation aneuploidies, polyploidies ? Incubation de quelques heures pour permettre repolymérisation

34 Congélation dovocytes Résultats Congélation lente 1 ère grossesse : Chen et al., enfants nés ( ) Implantation/100ovocytes décongelés : 2,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 2,3-2,2 (Oktay et al., 2006;2008) Vitrification 392 enfants nés ( ) Implantation/100ovocytes décongelés : 6,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 4,5-5,8 (Oktay et al., 2006;2008) Vitrification Technique prometteuse en évaluation

35 LA FECONDATION IN VITRO

36 La F.I.V. Stimulation de lovulation Temps Traitement hormonal Conjoint Désir denfants précipité ?

37 LA CRYOCONSERVATION DE TISSU OVARIEN

38 La cryoconservation du tissu ovarien Pas de stimulation de lovulation Pas de conjoint Désir denfants différé Femme < 35 ans Enfant Prélèvement per coelioscopique : Selon le risque estimé de castration : 1 ovaire entier ou ½ ovaire Transport au laboratoire dans lheure

39 La cryoconservation du tissu ovarien Garde cortex ovarien uniquement: réserve folliculaire 1-2 mm épaisseur Médullaire ôtée Découpe en bandelettes (5 x 10 mm) Conservation : Milieu cryoprotecteur (PROH, sucrose, …) Cryotubes Descente en température contrôlée -196°C

40 Utilisation du tissu ovarien congelé Seuls les follicules primordiaux et primaires résistent à la congélation Maturation : GREFFE Autogreffe : Orthotopique, pelvienne : restauration de la fertilité naturelle Hétérotopique : sous cutané, intra-musculaire, … : FIV Xénogreffe : Souris immunodéprimées (nude, SCID, …) CULTURE IN VITRO COMBINAISON greffe/culture in vitro ?

41 Greffe de tissu ovarien congelé/décongelé Autogreffe : Avantages "Simple" de réalisation Revascularisation spontanée Succès chez animal et lhumain Inconvénients : Risque de transmission de cellules cancéreuses Destruction folliculaire Congélation/décongélation (survie 10 à 70%) Ischémie post greffe (+++)

42 September 24, naissances rapportées à ce jour Donnez et al., 2004 Meirow et al., 2005 Demeestere et al., 2007 Andersen et al., 2008 Silber et al., 2008 Résultats

43 Culture in vitro Avantages : Zone pellucide : exclue toute cellule, métastatique Techniques : plusieurs étapes Fragments de cortex ovarien : initiation de croissance ( follicule préantral) Isole le follicule du cortex ( follicule antral) Isole l'ovocyte immature (follicule > 2 mm) maturation finale

44 Culture in vitro Résultats : Follicule primordial ovocyte mature : Une espèce : Souris Eppig and O'Brien, 1996 : 1 souris vivante décès prématuré troubles neurologiques et hépatiques, obésité OBrien et al., 2003 : 48 souriceaux vivants en bonne santé Femme : Follicule primordial secondaire (2 semaines !) Follicule secondaire antral Follicule antral ovocyte mature fécondable Maturation in vitro : 1 ère naissance : Veeck et al., 1983 Association xénogreffe puis culture in vitro ?

45 Copyright restrictions may apply. Telfer, E. E. et al. Hum. Reprod : ; doi: /humrep/den070 Histological sections of in vitro grown human follicles cultured first in cortical strips for 6 days (Step 1) then subsequently isolated at the pre-antral stage and cultured for a further 4 days (step 2) in the presence (A and B) or absence (C and D) of 100 ng/ml of activin A. TISSU FRAIS

46 Préserver la fertilité féminine ? BALANCE: Altération de la fertilité par le traitement Altération de la fertilité par le prélèvement dovaire (ovariectomie unilatérale ne divise pas le stock par deux) Conjoint ? Désir denfants ? Associer les différentes techniques Congélation cortex ovarien Congélation ovocytes immatures (follicules antraux) Enfant : information aux parents


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