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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: - Cinétique.

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1 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: - Cinétique

2 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.2 Réactions enzymatiques Préparons une réaction enzymatique: Enzyme (chacun = 1 µmol) Substrat (chacun = 1 µmol) Ce sont les seules concentrations que lon connait pcq nous préparons lexpérience. X min Produit

3 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.3 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 1. Détection du produit: pNA = para-nitroaniline Absorbe à 405 nm H 3 + N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-OH O OOO CH 2 COO - CH 2 COO - CH CH 3 H3CH3C CH 2 COO - NO 2 H2NH2N pNA (jaune) H 3 + N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH- O OOO CH 2 COO - CH 2 COO - CH CH 3 H3CH3C CH 2 COO - NO 2 DEVD-pNA (incolore) DEVD (incolore) Caspase 3 (protéase hydrolase) Mesure laugmentation de A 405nm

4 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.4 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 2. Accumulation/utilisation dun cofacteur: NADH = absorbe fortement à 340 nm ( = 6.3 molL -1 cm -1 ) NAD+ = nabsorbe pas à 340 nm Mesure laugmentation de A 340nm Mesure la diminution de A 340nm Lactate dehydrogenase

5 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.5 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 3. Réactions enzymatiques couplées: Très utiles lorsque ni le substrat/produit/cofacteur ne peut être facilement détecté; Glutaminase + NH 4 + 1 ière réaction Mesure laugmentation de A340nm Glutamate Dehydrogenase + NAD + + NADH +H + 2 ième réaction + NH 4 + + H 2 O Peut être détecté par HPLC (peu pratique)

6 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.6 Réactions enzymatiques 1 min 3 µmol / min Vitesse de la réaction 15 µmol S vs 1 µmol E Temps [Produit] Pente = vitesse initiale = v 0 = [P] / time 2 min 3 µmol / min 4 min <3 µmol / min

7 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.7 Réactions enzymatiques Temps [Produit] v 0 est proportionnel à [E] 1µmol E 2µmol E 3µmol E 1 min 3 µmol / min 15 µmol S vs 1 µmol E 1 min 6 µmol / min 15 µmol S vs 2 µmol E 1 min 9 µmol / min 15 µmol S vs 3 µmol E

8 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.8 Réactions enzymatiques 1 min 2 µmol / min 1 µmol / min 1 min 3 µmol / min 1 min [Substrat] v0v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E saturé par S

9 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.9 Réactions enzymatiques Donc: 1) v 0 (la vitesse initiale) est la vitesse réactionnelle très tôt après linitiation de la réaction quand [P] est négligeable; 2) v 0 peut être obtenue en prenant la pente du graphique de [P] vs temps (unités: concentration / temps) 3) v 0 varie en fonction de [E]; 4) v 0 augmente en fonction de [S] jusquà ce que E soit saturé par S. 5) Lorsque E est saturé par S v 0 = Vmax

10 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.10 Équation de Michaelis-Menten La relation entre v o et [S] peut être vue comme une réaction à 2 étapes: Cette relation peut être exprimée par léquation de Michaelis-Menten: [Substrat] v0v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E + S ES E + P k2k2 k1k1 k- 1 RAPIDELENT v o = Vmax [S] Km + [S]

11 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.11 Équation de Michaelis-Menten Km est équivalent à la concentration de [S] requise afin dobtenir la moitiée du Vmax; Km est une mesure de laffinité de E pour S: Plus Km est bas, moins on aura besoin de S pour que E atteigne ½ Vmax, et plus laffinité de E pour S sera élevée. [Substrat] v0v0 Vmax ½ Vmax Km1 Km2 E2 E1

12 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.12 Km

13 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.13 Turnover number A des concentrations de [S] saturantes: vo = Vmax vo est déterminé par [E] k 2 caractérisera la vitesse de la réaction; k 2 = k cat Donc: Vmax = k cat [E] totale k cat = Vmax/[E] totale k cat = turnover number = nombre maximum de molécules de substrat converties en produit par seconde par site actif de lenzyme (units = s -1 ); 1/k cat = temps requis pour que E convertisse 1 molécule de substrat en produit (i.e. temps requis pour une réaction catalytique). Unités: s. E + S ES E + P k2k2 k1k1 K- 1 RAPIDELENT

14 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.14 Mesure de Km et Vmax Km ou Vmax ne peuvent pas être directement obtenus à partir de données de cinétique enzymatiques: Vmax est rarement atteint (cest une courbe de type hyperbole…); [Substrate] v0v0 Vmax ½ Vmax Km

15 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.15 Mesure de Km et Vmax Cependant, on peut facilement obtenir Km et Vmax en prenant la réciproque (et en réarrangeant un peu) léquation de Michaelis- Menten: on obtient alors léquation de Lineweaver-Burk: Le graphique de 1/vo vs 1/[S] donne une droite dont: Intercepte sur laxe des x = -1/Km Intercepte sur laxe des y = 1/V max Cest la façon la plus facile pour déterminer avec précision Vmax et Km: Tu connais [S] (cest toi qui a préparé lexpérience!!!) V 0 est facilement obtenue expérimentalement (pente de [P] vs temps). 1/v o 1/[S] 1/V max -1/Km Graphe de Lineweaver-Burk 1vo1vo = Km x 1 + 1 Vmax [S] Vmax


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