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CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: - Cinétique.

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1 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D. 1 CHMI 2227F Biochimie I Enzymes: - Cinétique

2 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.2 Réactions enzymatiques Préparons une réaction enzymatique: Enzyme (chacun = 1 µmol) Substrat (chacun = 1 µmol) Ce sont les seules concentrations que lon connait pcq nous préparons lexpérience. X min Produit

3 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.3 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 1. Détection du produit: pNA = para-nitroaniline Absorbe à 405 nm H 3 + N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-OH O OOO CH 2 COO - CH 2 COO - CH CH 3 H3CH3C CH 2 COO - NO 2 H2NH2N pNA (jaune) H 3 + N-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH-CH-C-NH- O OOO CH 2 COO - CH 2 COO - CH CH 3 H3CH3C CH 2 COO - NO 2 DEVD-pNA (incolore) DEVD (incolore) Caspase 3 (protéase hydrolase) Mesure laugmentation de A 405nm

4 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.4 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 2. Accumulation/utilisation dun cofacteur: NADH = absorbe fortement à 340 nm ( = 6.3 molL -1 cm -1 ) NAD+ = nabsorbe pas à 340 nm Mesure laugmentation de A 340nm Mesure la diminution de A 340nm Lactate dehydrogenase

5 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.5 Réactions enzymatiques Comment mesure-t-on lactivité enymatique? 3. Réactions enzymatiques couplées: Très utiles lorsque ni le substrat/produit/cofacteur ne peut être facilement détecté; Glutaminase + NH ière réaction Mesure laugmentation de A340nm Glutamate Dehydrogenase + NAD + + NADH +H + 2 ième réaction + NH H 2 O Peut être détecté par HPLC (peu pratique)

6 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.6 Réactions enzymatiques 1 min 3 µmol / min Vitesse de la réaction 15 µmol S vs 1 µmol E Temps [Produit] Pente = vitesse initiale = v 0 = [P] / time 2 min 3 µmol / min 4 min <3 µmol / min

7 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.7 Réactions enzymatiques Temps [Produit] v 0 est proportionnel à [E] 1µmol E 2µmol E 3µmol E 1 min 3 µmol / min 15 µmol S vs 1 µmol E 1 min 6 µmol / min 15 µmol S vs 2 µmol E 1 min 9 µmol / min 15 µmol S vs 3 µmol E

8 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.8 Réactions enzymatiques 1 min 2 µmol / min 1 µmol / min 1 min 3 µmol / min 1 min [Substrat] v0v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E saturé par S

9 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.9 Réactions enzymatiques Donc: 1) v 0 (la vitesse initiale) est la vitesse réactionnelle très tôt après linitiation de la réaction quand [P] est négligeable; 2) v 0 peut être obtenue en prenant la pente du graphique de [P] vs temps (unités: concentration / temps) 3) v 0 varie en fonction de [E]; 4) v 0 augmente en fonction de [S] jusquà ce que E soit saturé par S. 5) Lorsque E est saturé par S v 0 = Vmax

10 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.10 Équation de Michaelis-Menten La relation entre v o et [S] peut être vue comme une réaction à 2 étapes: Cette relation peut être exprimée par léquation de Michaelis-Menten: [Substrat] v0v0 Vitesse maximale = Vmax Vmax ½ Vmax E + S ES E + P k2k2 k1k1 k- 1 RAPIDELENT v o = Vmax [S] Km + [S]

11 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.11 Équation de Michaelis-Menten Km est équivalent à la concentration de [S] requise afin dobtenir la moitiée du Vmax; Km est une mesure de laffinité de E pour S: Plus Km est bas, moins on aura besoin de S pour que E atteigne ½ Vmax, et plus laffinité de E pour S sera élevée. [Substrat] v0v0 Vmax ½ Vmax Km1 Km2 E2 E1

12 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.12 Km

13 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.13 Turnover number A des concentrations de [S] saturantes: vo = Vmax vo est déterminé par [E] k 2 caractérisera la vitesse de la réaction; k 2 = k cat Donc: Vmax = k cat [E] totale k cat = Vmax/[E] totale k cat = turnover number = nombre maximum de molécules de substrat converties en produit par seconde par site actif de lenzyme (units = s -1 ); 1/k cat = temps requis pour que E convertisse 1 molécule de substrat en produit (i.e. temps requis pour une réaction catalytique). Unités: s. E + S ES E + P k2k2 k1k1 K- 1 RAPIDELENT

14 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.14 Mesure de Km et Vmax Km ou Vmax ne peuvent pas être directement obtenus à partir de données de cinétique enzymatiques: Vmax est rarement atteint (cest une courbe de type hyperbole…); [Substrate] v0v0 Vmax ½ Vmax Km

15 CHMI E.R. Gauthier, Ph.D.15 Mesure de Km et Vmax Cependant, on peut facilement obtenir Km et Vmax en prenant la réciproque (et en réarrangeant un peu) léquation de Michaelis- Menten: on obtient alors léquation de Lineweaver-Burk: Le graphique de 1/vo vs 1/[S] donne une droite dont: Intercepte sur laxe des x = -1/Km Intercepte sur laxe des y = 1/V max Cest la façon la plus facile pour déterminer avec précision Vmax et Km: Tu connais [S] (cest toi qui a préparé lexpérience!!!) V 0 est facilement obtenue expérimentalement (pente de [P] vs temps). 1/v o 1/[S] 1/V max -1/Km Graphe de Lineweaver-Burk 1vo1vo = Km x Vmax [S] Vmax


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