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Préparation des échantillons ABC/BVC Mai 2002 – Montgodinne N.Schaaf-Lafontaine Laboratoire dHématologie CHU ULg.

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1 Préparation des échantillons ABC/BVC Mai 2002 – Montgodinne N.Schaaf-Lafontaine Laboratoire dHématologie CHU ULg

2 Cellules et Flux u Le cytomètre de flux analyse la fluorescence et la lumière diffusée de cellules en suspension. u Si les cellules sont en suspension dans léchantillon (cultures, sang…), la préparation et lanalyse sont directes tandis que dans le cas de tissus solides, il faut une étape supplémentaire de dissociation. u Le volume de suspension cellulaire requis est habituellement 0.5 ml et la concentration idéale 10 5 à 10 6 cellules /ml. u La suspension cellulaire ne doit pas contenir de débris cellulaires ni daggrégats afin de réduire les risques dobstruction des tubulures. u Lorsque lexpression de la molécule recherchée est à la fois intracellulaire et membranaire, il faut sassurer de la localisation détectée.

3 Fluorochromes u Les anticorps monoclonaux et polyclonaux (préparations purifiées ou fractions Fab2 de préférence) sont couplés à lisothiocyanate de fluorescéine (FITC) le plus souvent. u Pour la réalisation de marquages multiples, on utilise simultanément des anticorps monoclonaux couplés chacun à un fluorochrome différent. u Avec un laser argon 488 nm, les combinaisons les plus courantes sont : FITC/PE FITC/IP FITC/PE/PerCP FITC/RD1/ECD/PC5….. u Avec 2 lasers (Argon 488nm et HeNe 633 nm) FITC/PE/APC FITC/PE/ECD/APC

4 Méthode directe / Méthode indirecte u Il est possible de conjuguer (covalence) des protéines et dautres molécules à des colorants fluorescents tout en préservant leur activité biologique. De tels conjugués peuvent ensuite être utilisés pour la détection des molécules auxquelles ils se lient. u Certaines de ces molécules fluorescentes ont la propriété de se lier directement à des éléments cellulaires (par ex. Ac.nucl.). u Il est possible de coupler ces fluorochromes à des anticorps monoclonaux ou polyclonaux sans perte de spécificité lors de la liaison à lantigène.

5 Titration des réactifs anticorps u Il est recommandé de titrer les préparations danticorps utilisés (commerciales ou non) sur les populations cellulaires dintérêt. u Cette titration est réalisée par dilutions successives du réactif pour un nombre standard de cellules ( 10 6 dans 100 µl pour chaque dilution). Le même volume de réactif étant utilisé pour chaque point. u Pour une manipulation comprenant lavage suivi de fixation, la dilution précédant lintensité maximale est choisie.

6 Immunomarquage (1) u Les Anticorps sont généralement conservés en solution en présence dazide u Les anticorps non couplés sont très stables et leur réactivité peut se maintenir pendant des années à condition de ne pas subir de fréquents cycles de congélation-décongélation. u Les Anticorps couplés à un fluorochrome sont beaucoup moins stables et seront conservés à 4°C, dans lobscurité et en présence dazide. u Les Anticorps monoclonaux qui reconnaissent un même antigène, à moins dappartenir à un même clone, peuvent différer en spécificité dépitope, avidité, isotype et réaction croisée. u Le marquage aspécifique de bruit de fond et les réactions croisées sont plus faibles après marquage par Anticorps monoclonaux (versus polyclonaux). u Toutes les réactions Anticorps-Antigène sont réversibles. Les cellules colorées seront maintenues à 4°C. Lanalyse de fluorescence après immunomarquage se fait dautant plus rapidement que les cellules ne sont pas fixées.

7 Immunomarquage (2) Les anticorps vont se lier aux cellules non seulement par une réaction spécifique paratope-épitope mais aussi, avec une affinité plus faible cependant, par une réaction aspécifique à dautres éléments cellulaires. Les récepteurs pour le fragment Fc des Igs exprimés à la surface de certaines cellules sont en partie responsables de ce type de liaison. Le choix des réactifs dimmunomarquage, la classe ou sous-classe des anticorps, sera adapté aux propriétés des cellules étudiées. Les réactifs IgM génèrent fréquemment ce type de réaction aspécifique. Cette liaison est dautant plus importante que le réactif contient des aggrégats dIgs. Ceux-ci seront en partie éliminés par une courte ultracentrifugation. La liaison aspécifique sera réduite si les cellules lavées ou isolées sont prétraitées par des Igs normales non couplées ou par du sérum de même origine (espèce) que les anticorps « réactifs ». -10 µg dIgs contrôles purifiées de même origine pour 10 6 cellules 10 min. à 4°C - 2-5% de sérum inactivé avant laddition du réactif dimmunomarquage - utilisation de BSA (0.5 à 10%) ou de SVF dans le milieu de lavage et dincubation des cellules.

8 FIXATEUR u PARAFORMALDEHYDE u Forme polymérisée de Formaldéhyde, solide à T° ambiante mais se dissout lentement en solution aqueuse en chauffant à 60°C pendant 1heure ou plus Sous hotte (Toxicité) u Une polymérisation survient progressivement en solution aqueuse ; il faut préparer régulièrement (7 jours) une solution fraîche u Formaldéhyde ne convient pas à lexception du réactif « microscopie électronique » u Les solutions de fixation pour cytométrie proposées par les firmes conviennent u La fixation : - modifie le plus souvent lantigénécité des protéines de surface u des protéines cytoplasmiques - ne modifie pas la portion carbohydrates des gps - de préférence à T° ambiante et en absence de protéines extracell.(sérum par ex.) - augmente lautofluorescence des cellules u La fixation perméabilise les cellules: concentration faible: de petites molécules pénètrent concentration forte: des molécules danticorps peuvent pénétrer u Après immunomarquage des cellules, la conservation de fluorescence est possible. Lexcès de protéines est éliminé par lavages et le stockage a lieu dans une solution 1% de paraformaldéhyde en PBS

9 Prélèvement de Sang périphérique u Cet échantillon est hétérogène du point de vue de la cellularité et sera manipulé différemment selon la population dintérêt. Les cytomètres ont la propriété de distinguer ces populations en fonction de leurs caractéristiques de diffusion de la lumière. u Le sang est prélevé dans un tube contenant un anti-coagulant. Les caractéristiques morphologiques et de diffusion de lumière des cellules seront mieux préservées en présence dHéparine. LEDTA réduit le Ca2+ libre et peut altérer lanalyse des fonctions dépendantes de Ca2+. u Le prélèvement est immédiatement homogénéisé avec lanicoagulant par retournements lents. Les tubes en polypropylène, comparés au verre et au polystyrène, ont la propriété doffrir des conditions minimales dadhérence et dactivation des plaquettes et des éléments myéloides. u Les échantillons ne doivent pas être refroidis mais maintenus à 20°C environ. u Limmunomarquage sera réalisé le plus rapidement possible sur un échantillon ne contenant pas de traces de coagulation. u Les plaquettes activées peuvent former des aggrégats importants qui interfèrent avec lanalyse des leucocytes.

10 Immunophénotypage des Leucocytes du sang u Les érythrocytes non-nucléés constituent la population majeure dans le sang et leur grand nombre va réduire la vitesse danalyse des leucocytes. u Pour cette raison, les leucocytes peuvent être isolés: - par centrifugation sur gradient de densité. - par lyse des érythrocytes Les érythrocytes nucléés présents dans le sang des jeunes enfants et dans les prélèvements de moelle osseuse sont résistants à la lyse et ont des propriétés FSC/SSC proches de celles des lymphocytes. Il est possible de distinguer ces 2 populations en utilisant un marquage: - anti-CD45 (Gp présente sur les leucocytes et non sur les plaquettes et les érythrocytes) - anti-Glycophorin A (erythr+/lympho-)

11 Prélèvement de moelle osseuse u Le prélèvement se fait en présence danticoagulant et les échantillons sont conservés à 20°C et traités le plus rapidement possible. La cellularité est hétérogène. Des érythrocytes nucléés ou non sont présents et seront éliminés (cfr sang) si le but de lanalyse est limmunophénotypage des leucocytes. u Le prélèvement peut contenir une certaine quantité de sang; il ne sera pas possible didentifier les origines respectives des cellules analysées. Il est utile de se référer aux prélèvements prévus pour lanalyse cytologique. u Les analyses les plus fréquentes sont: -immunophénotypage des leucocytes - évaluation des cellules CD34+ - index ADN

12 Lyse des Erythrocytes u Lapplication, aux prélèvements de sang et de moelle osseuse, des techniques de lyse des hématies permet lanalyse des leucocytes des échantillons non séparés sur gradient de densité. u Différentes méthodes sont proposées dans la littérature : H2O, solution de NH4Cl, Saponine. De nombreuses solutions commerciales sont proposées. u La prudence simpose dans le choix de la méthode et la technique sera soigneusement validée pour chaque application. Certaines cellules nucléées ne conservent pas toutes leurs propriétés au cours de ces manipulations. u Les solutions commerciales contiennent parfois des éléments fixateurs; dans ce cas, lincubation des cellules avec les réactifs dimmunophénotypage doit seffectuer avant létape de lyse. u Dans tous les cas, ces solutions seront conservées soigneusement et très régulièrement préparées (quelques jours !!!) et utilisées à T° ambiante.

13 Suspensions cellulaires réalisées à partir de tissus solides ou de cultures u Par traitements enzymatiques: Trypsine Collagénase Dispase u Par moyens mécaniques : ciseaux petit scalpel potter en verre tamis métallique. u Des agents chélatants (EDTA ou Citrate) sont utilisés avec la Trypsine par ex; ce qui empêche Ca2+ et Mg2+ de maintenir la stabilité de la matrice. Seuls, ces agents ne peuvent libérer les cellules. Lactivité collagénase requiert la présence de Ca2+, il ne faut donc pas introduire ces agents lors de ces manipulations. u Lemploi de Dnase permet de limiter la formation daggrégats cellulaires autour de lADN libéré par les cellules endommagées. u La digestion enzymatique fournit généralement une suspension cellulaire de viablilté supérieure à celle obtenue par dissociation mécanique. Certaines molécules de la surface cellulaire pourraient subir un clivage lors de lincubation en présence denzymes. Il faut contrôler la résistance de lépitope spécifique des anticorps monoclonaux utilisés en immunomarquage. u

14 Tests Fonctionnels u Les cellules analysées en cytométrie de flux après immunomarquage peuvent être triées sur base de lexpression de certaines molécules et ensuite utlisées dans des tests fonctionnels (migration, cycle cellulaire, expansion clonale,…). u Dans ce type dapplication, la viabilité des cellules est essentielle; elle sera évaluée dès le départ des manipulations : u Bleu Trypan (colorant vital) u Iodure de Propidium (se lie à lADN des cell.mortes) u Les cellules endommagées ou mortes, susceptibles dentraîner la formation daggrégats, seront retirées de la suspension cellulaire par : filtration sur filtre de nylon par ex. ou centrifugation en gradient de densité. u La survie sera assurée par une incubation en milieu nutritif (Milieu de Culture RPMI 1640 ou solution saline de Hanks) dépourvu dindicateur coloré tel que Rouge phénol. Le pH du milieu doit être maintenu stable (utilisation de Hepes possible). u Des protéines, saturation des sites de liaison non-spécifiques, seront ajoutées dans le milieu dincubation. BSA ou sérum, ce dernier sera décomplémenté car il pourrait activer le clivage de certaines molécules de la surface cellulaire. u La T° sera maintenue à 4°C après immunomarquage car la présence danticorps liés à certaines structures de la membrane plasmatique peut induire du « capping » voire de linternalisation des structures recherchées.

15 Perméabilisation u Etape nécessaire pour la détection dantigènes intracellulaires ( enzymes, cytokines*…) par immunomarquage. u Les anticorps couplés sont des macromolécules de taille importante, leur entrée dans la cellule requiert une perméabilisation préalable ou simultanée à létape dimmunomarquage. En même temps: éviter la diffusion de lantigène recherché conserver les caractéristiques FSC/SSC des cellules Ces conditions sont rencontrées en fixant les cellules (paraformaldéhyde) de façon à stabiliser les membranes et ensuite en incubant en présence des anticorps**, de Saponin (perméabilisant) et dun agent bloquant (SVF ou BSA pour réduire la liaison non- spécifique). Effectuer les lavages en présence de Saponin. Dautres combinaisons sont possibles, par ex. Méthanol/Acétone, Ethanol 70% et réactifs commerciaux. Chaque antigène recherché nécessite une mise au point précise qui respectera les caractéristiques FSC/SSC et évitera les liaisons aspécifiques. Des contrôles seront réalisés en parallèle. *en présence de brefeldine les cytokines produites sont piégées dans la cellule. **méthode directe ou indirecte de marquage

16 Recommandations u Les fluorochromes sont sensibles à la lumière et au pH. u Les réactifs Anticorps se périment. u Les solutions de lyse et de fixation saltèrent rapidement u La qualité de limmunomarquage et de lanalyse en cytométrie dépend de la qualité de léchantillon cellulaire. Un contrôle des résultats est possible au microscope à fluorescence après le passage au cytomètre. u Une manipulation mal entamée ne peut se corriger. u Certains réactifs sont toxiques (Azide, PAF, IP…) u Il faut se protéger de la formation daérosols. u Les prélèvements de sang humain (moelle, tissus lymphoides,..) sont susceptibles dêtre contagieux.

17 Ouvrages de Références u Cytometric Analysis of Cell Phenotype and Function. Eds D.A. McCarthy and M.G.Macey. Cambridge University Press u Immunophenotyping. Eds C.C.Stewart and J.K.A.Nicholson.Wiley-Liss u Immunophénotypage des Leucocytes. Clusters de différenciation humains. Application à la caractérisation des Hémopathies; O.Lees, M.C.Béné et les membres du GEIL. Biothem Editions u Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice. M.A.Owens and M.R.Loken.Eds Wiley-Liss


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