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OBJECTIF VACCINER LES LAPINS SAUVAGES CONTRE LA VHD, SANS AVOIR À LES CAPTURER. Sans oublier les lièvres contre lEBHS.

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1 OBJECTIF VACCINER LES LAPINS SAUVAGES CONTRE LA VHD, SANS AVOIR À LES CAPTURER. Sans oublier les lièvres contre lEBHS

2 Pistes déjà explorées 1/ Production de capsides sans noyaux (vaccin commercial) - Valable pour les élevages 2/ Recombinants Myxo-VHD (Ecole Véto Toulouse et équipe espagnole) -Efficacité terrain non prouvée (mauvais choix de départ) -LONC aujourdhui à des a priori contre de telles recherches si elles étaient tentées par Bio-Espace, après les avoir soutenues lorsquelles étaient menées par les équipes citées ci-dessus 3/ contre lEBHS rien.

3 Notre approche ? Elle consiste à vouloir obtenir un virus atténué de la VHD, et à lutiliser comme vaccins. (analogue à notre stratégie myxo) naturelle

4 Pourquoi une telle stratégie ? 1/ Il nexiste pas de solutions au problème posé 2/ Notre approche est cohérente avec lair du temps, 3/ Elle nest scientifiquement pas utopique.

5 En effet, Le virus naturellement atténué de la VHD existe. Travaux des Italiens (Capucci et al) Intéressant, Mais virus trop atténué Difficilement multipliable. Mais conclusion, il existe, et on en connaît le code.

6 Virus de la VHD détails

7 Virus de la Myxomatose 2OO nm ADN double brin Paires de bases Virus de la VHD 40 nm ARN simple brin 7437 bases 125 fois moins volumineux que celui de la myxo

8 Virus pathogène de la VHD Structure déterminée aux rayons X. Forme géométrique Icosahedre (20 faces) La capside que lon voit est uniquement constituée dune même protéine repétée plusieurs fois (VP60, 579 aminoacides). Le code est à lintérieur sous la forme du brin dARN de 7437 b.

9 Voyons comment un virus tue.

10 Il se réplique dans certaines cellules. Pour rentrer il utilise ses sites de reconnaissance situés sur la capside.

11 (suite) Il se multiplie dans le foie, nécrose cet organe et détruit les facteurs de coagulation. En même temps il agresse les parois des capillaires. La conséquence cest lhémorragie.

12 Défenses du lapin.

13 Le lapin crée des anticorps contre ces virus Virus VHD Le système immunitaire du lapin crée des anticorps Le virus emprisonné par les anticorps est éliminé

14 Lanticorps se lie à quoi ? Aux protéines de la capside.

15 Importance de la capside, Dans un virus pathogène, les protéines (VP60) de la capside ont 579 AA. Dans un virus naturellement atténué (celui de Capucci), les protéines (VP60) de la capside ont 576 AA. Le premier tue, le second protège.

16 Peut on produire le virus trop atténué de Capucci, ou un autre encore plus intéressant ? pas de façon classique mais en faisant de la mutagénèse dirigée. Cest notre programme de recherche.

17 Mutagénèse dirigée Lobjectif est de modifier la structure de la capside, tout en gardant le virus entier.

18 Virus pathogène de la VHD Capside, constituée de la même protéine (579 aminoacides) repétée plusieurs fois. code ARN 7437 b, à lintérieur.

19 Le code VHD est un ARN simple brin. (7437b) Il est fragile. Nous lavons traduit en ARN double brin, plus stable pour létudier et le modifier.

20 Code ADN à double brin

21 VHD souche Pascal 1/ Foie de lapin envoyé par Pascal. 2/ Extraction de lARN viral 3/ Transcription en ADN 4/ Lecture du code Résultats :

22 Les 3960 premières pb de notre virus de la VHD

23 Les 3477 pb suivantes. au total 7437 pb

24 Dans les conditions naturelles la capside se forme dans les cellules par lecture du code

25 Nous avons Identifié et isolé la seule partie du code qui exprime la protéine VP60.

26 Les 3960 premières pb du virus de la VHD Elle nest pas là.

27 En rouge les 1737 pb du gène codant pour la VP60 Elle est là.

28 Le code VP60 de notre virus pathogène (Pascal) À celui du virus non pathogène de Capucci. Résultat : Nous avons comparé,

29 Dans les 840 premières pb, lalignement est identique

30 On note une différence entre 900 et 960 pb

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32 Rien à la fin

33 Traduit en code AA, cela donne

34 Comparaisons entre VHD non pathogène (Capucci) VHD pathogènes souches –France –Espagne –Italie –Allemagne Et la souche EBHS pathogène pour le lièvre

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36

37 Conclusions Peu de différences

38 Comment intervenir Pour modifier ces codes, et rendre moins pathogènes ces virus qui tuent les lapins et les lièvres.

39 Genome viral complet Extrait du foie dun lapin Envoyé par Pascal. Vecteurs de clonage (ou plasmides) DNA 3000 Pb Capables de vectoriser les DNA Ligation de l ADN du génome avec le vecteur de DNA plasmide recombiné Incorporation dans une bacterie Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide. Processus général de clonage dun génome

40 Clonage dun gène Genome viral complet Extrait du foie dun lapin Envoyé par Pascal. Vecteurs de clonage (ou plasmides) DNA 3000 Pb Capables de vectoriser les DNA Ligation de l ADN du génome avec le vecteur de DNA plasmide recombiné Incorporation dans une bacterie Multiplication du plasmide par la bactérie. Et extraction du plasmide. fraction du génome Correspondant à la VP60

41 Nous avons cloné le gène de la protéine VP60 (traduit en langage ADN), nous lavons incorporé dans un plasmide, et lavons multiplié dans une bactérie. Nous allons faire la même chose pour le génome complet du virus de la VHD

42 Nous allons voir comment il est possible de remplacer certaines lettres dun code par dautres lettres plus intéressantes.

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44 Que faire dun génome modifié, inséré dans un plasmide.

45 Il faut lintroduire dans une cellule pour que celle-ci redonne le virus reconstruit. On parle alors de transfection, par opposition à infection. Le piège à éviter lors de ces transfections, Cest la digestion des plasmides par des enzymes particulières dès lentrée dans la cellule.

46 Comment éviter ces enzymes En protégeant les plasmides par des macromolécules spéciales.

47 Un plasmide cest un polyanion. On le protége avec un polycation à condition que ce dernier ne soit pas toxique pour la cellule

48 Ces molécules existent Nous sommes en train den créer dautres. ++ +

49 Certaines sont linéaires

50 Dautres sont sphériques

51 Etapes nécessaires pour livrer efficacement les plasmides. Nucleus Nuclear Import Complexes DNA Protégés, vers des cellules cibles.

52 Conclusion Nous avons, en 7 mois : 1/Analysé exhaustivement la littérature, et affiné notre stratégie de recherche. 2/ Isolé le virus de la VHD, 3/Analysé son code génétique. 4/ Comparé celui-ci à celui du virus naturellement atténué de Capucci 5/ Comparé à celui de lEBHS du lièvre 6/ Isolé le gène de la VP60, et cloné celui-ci dans un plasmide. 6/ Créé des molécules de transfection, et les avons testé parmi dautres. 7/ Abordé la recherche de cellules permissives.

53 Merci à tous Pour votre patience et pour votre attention.


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