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Étude du déterminisme de maturation et dinfectiosité des virus des hépatites B et D Laboratoire de virologie moléculaire Camille SUREAU Institut National.

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1 Étude du déterminisme de maturation et dinfectiosité des virus des hépatites B et D Laboratoire de virologie moléculaire Camille SUREAU Institut National de la Transfusion Sanguine PARIS Laboratoire de virologie moléculaire Camille SUREAU Institut National de la Transfusion Sanguine PARIS

2 Le virus de lhépatite B (HBV)

3 Généralités (i) Plus de 350 millions de patients sont chroniquement infectés par HBV (OMS). Il existe un vaccin efficace et sûr depuis Infection HépatiteAiguë Guérison Chronicité HépatitechroniqueCirrhoseHépatocarcinome Porteurs sains 95% 5% 70% 30%

4 Généralités (ii) Hepadnaviridae OrthohepadnavirusHBVWMHBVGSHVWHVAvihepadnavirusDHBVHHBV

5 Les particules HBV 100 nm Diamètre: 42 à 46 nm Diamètre: 20 nm Longueur variable Diamètre: 20 nm

6 Le virion mature: la particule de Dane

7 Le génome HBV ADN circulaire partiellement bicaténaire Organisation génétique très compacte: tous les nucléotides sont codants les ¾ sont inclus dans deux ORF quatre ORF sont présentes Sept protéines virales : polymérase virale protéine X (non structurale) protéine de capside protéine « e » (AgHBe) trois protéines denveloppe

8 Le Cycle de réplication HBV

9 Les protéines denveloppe HBV

10 La topologie des protéines denveloppe HBV S-AgHBs M-AgHBs

11 La protéine L-AgHBs pre-S1 cytosolique pre-S1 luminale CI RE

12 Les fonctions des protéines denveloppe (i) S- et L-AgHBs sont nécessaires à la maturation HBV S- et L-AgHBs sont nécessaires à la maturation HBV M-AgHBs na pas de rôle connu M-AgHBs na pas de rôle connu In vitro S-AgHBs fournit le moteur du bourgeonnement S-AgHBs fournit le moteur du bourgeonnement

13 L-AgHBs, par sa topologie pre-S cytosolique, permet le recrutement de la nucléocapside HBV [Domaine matrice (92-à-113)]. [Domaine matrice (92-à-113)]. Les fonctions des protéines denveloppe (ii)

14 L-AgHBs, par sa topologie pre-S externe permet la ttachement au récepteur de la cellule cible (entrée virale). (entrée virale). Les fonctions des protéines denveloppe (iii)

15 Les fonctions des protéines denveloppe (iv) Les protéines denveloppe HBV bourgeonnent spontanément dans la lumière du RE, principalement sous forme de PSV. Les protéines denveloppe HBV bourgeonnent spontanément dans la lumière du RE, principalement sous forme de PSV. La nucléocapside HBV peut être recrutée pour former des virions matures. La nucléocapside HBV peut être recrutée pour former des virions matures. Une autre structure virale peut être enveloppée. Il sagit dune structure ribonucléoprotéique appartenant au virus de lhépatite delta. Une autre structure virale peut être enveloppée. Il sagit dune structure ribonucléoprotéique appartenant au virus de lhépatite delta.

16 Le virus de lhépatite delta (HDV)

17 Généralités HDV est: Un virus enveloppé à ARN (-) Un virus enveloppé à ARN (-) Un virus défectif, satellite occasionnel dHBV, qui requiert la présence des protéines denveloppe dHBV pour accomplir son cycle infectieux Un virus défectif, satellite occasionnel dHBV, qui requiert la présence des protéines denveloppe dHBV pour accomplir son cycle infectieux Le seul membre du genre Deltavirus Le seul membre du genre Deltavirus

18 Le virion HDV

19 LARN HDV

20 Les protéines delta (AgHD) S-AgHD S-AgHD stimule la réplication de lARN HDV L-AgHD L-AgHD inhibe la réplication et dirige la maturation

21 La réplication du génome HDV Pol-II

22 Cycle de réplication HDV

23 Maturation HDV S-AgHBs est suffisante pour la maturation HDV : elle assure le bourgeonnement elle assure le bourgeonnement elle possède un domaine matrice HDV elle possède un domaine matrice HDV L-AgHBs indispensable à lentrée virale HDV car elle porte le domaine dattachement au récepteur. L-AgHBs est indispensable à lentrée virale HDV car elle porte le domaine dattachement au récepteur.

24 Travail de thèse

25 Objectifs de la recherche Recherche dans les BCY-I et –II de: Recherche dans les BCY-I et –II de: déterminants de maturation HBV et HDV ? déterminants de maturation HBV et HDV ? déterminants dinfectiosité ? déterminants dinfectiosité ? Recherche dans le domaine pre-S de L-AgHBs de: Recherche dans le domaine pre-S de L-AgHBs de: déterminants dinfectiosité HDV ? déterminants dinfectiosité HDV ? (Comparaison avec les déterminants HBV)

26 État des connaissances sur la maturation Domaine matrice : résidus 92 à 113 sur pre-S. Bruss, V. (1997). J Virol 71, Déterminant de maturation HBV: résidus 35 à 59 et R79 de la BCY-I. Loffler-Mary, H.,et coll.(2000). Virology 270, Domaine matrice : W-196,-199,-201 BCY-II. Jenna, S., et Sureau, C. (1999). J virol 73, Komla-Soukha, I., et Sureau, C. (2006). J virol 80, La moitié C-terminale de BCY-I na pas été étudiée pour la maturation des virions car les grandes délétions sont délétères pour la stabilité des protéines. HBV HDV

27 État des connaissances sur lentrée virale Boucle Antigénique : impliquée à létape dentrée virale. Jaoudé, G. A., et Sureau, C. (2006). J virol 79, Déterminant dinfectiosité : résidus 1 à 77 de pre-S1. Le Seyec, J. et coll. (1999). J virol 73, Myristate Bruss, V. et coll (1996). Virology 218, Domaine dattachement au récepteur : résidus 2 et 48 de pre-S1. Gripon, P. et coll. (2005). J virol 79, Séquence TLM (résidus 149 à 160): impliquée à lentrée virale. (Stoeckl, L. et coll., (2006). PNAS 103, TLM

28 1ere Partie Déterminants de maturation et dinfectiosité HBV et HDV dans les BCY-I et –II

29 Création et criblage de mutations permissives pour la secrétion de PSV dans la BCY-I (démarche expérimentale) 1.Transfection de cellules Huh-7 avec: pT7HB2.7 ou dérivé 2.Analyse à J4 des protéines denveloppe présentes dans les cellules et les surnageants par WB (anti-S + anti-pre-S2) Pour létude de la maturation HBV et HDV, les mutations doivent être permissives pour la sécrétion de PSV.

30 Mutants BCY-I

31 Quelles sont les mutations BCY-I permissives pour la secrétion de PSV? Mutants permissifs pour la sécrétion de PSV obtenus pour lintégralité de la BCY-I.

32 La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HBV? 1.Transfection de cellules Huh-7 avec: pCIHBenv(-) pT7HB2.7 ou dérivé 2.Analyse (J11) ADN HBV cellule surnageant : IP anti-preS1 protéines denveloppe surnageant : ELISA anti-HBs Mutation permissive quand le rapport ADN viral / protéines denveloppe dans le surnageant est conservé.

33 La BCY-I ne contient pas de déterminant majeur de maturation HBV. La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HBV?

34 1.Transfection de cellules Huh-7 avec: pSVLD3 pT7HB2.7 ou dérivé 2.Analyse (J12) ARN HDV (Cellules et surnageant) protéine denveloppe (Surnageant) Mutation permissive quand le rapport ARN viral / protéines denveloppe dans le surnageant est conservé. La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV ? (démarche expérimentale)

35 La BCY-I ne contient pas de déterminant majeur de maturation HDV. La BCY-I est-elle impliquée dans la maturation HDV?

36 La BCY-I a t-elle un rôle à lentrée virale ? (modèle HDV) (démarche expérimentale) 1.Normalisation des surnageants (ARN HDV) 2.Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG) 3.Détection de lARN HDV dans les cellules 7 jours après inoculation Mutation permissive quand la concentration en ARN HDV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage.

37 La BCY-I ne contient pas de déterminant majeur pour linfectiosité HDV. La BCY-I a t-elle un rôle à lentrée virale ? (modèle HDV)

38 Les résidus W-196, -199, -201 de la BCY-II ne sont pas nécessaires à la maturation HBV. Les résidus Trp de la BCY-II sont-ils impliqués dans la maturation HBV ?

39 1.Normalisation des surnageants (ADN HBV) (dilution en série) 2.Inoculation de cellules HepaRG (16 h, PEG) 3.Détection de lARNm HBV dans les cellules 12 jours après inoculation Mutation permissive quand la concentration en ARNm HBV dans les cellules est équivalente à celle observée pour le type sauvage. Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à létape dentrée virale ? (modèle HBV) (démarche expérimentale)

40 Les résidus W-196, -199, et -201 de la BCY-II ne sont pas nécessaires à linfectiosité HBV. Les résidus Trp de la BCY-II ont-ils un rôle à létape dentrée virale ? (modèle HBV)

41 Conclusion 1 La BCY-I ne contient pas de déterminant de maturation ni dinfectiosité HBV ou HDV. La BCY-I ne contient pas de déterminant de maturation ni dinfectiosité HBV ou HDV. (Résidus Asp-33;Cys-48,-65,-69,-76;Tyr-72;Arg-73 (Résidus Asp-33;Cys-48,-65,-69,-76;Tyr-72;Arg-73 non testés car leur mutation nest pas compatible avec la sécrétion des PSV) Les Trp-196, -199, et -201, de la BCY-II nont pas de rôle dans la maturation et linfectiosité HBV. Les Trp-196, -199, et -201, de la BCY-II nont pas de rôle dans la maturation et linfectiosité HBV. Blanchet, M., et Sureau, C. (2006). J virol 80,

42 2ème partie Déterminants dinfectiosité HDV et HBV dans le domaine pre-S de L-AgHBs.

43 Démarche expérimentale 1. Production de virions HDV ou HBV exprimant L- et S-AgHBs (simplification du modèle par absence de M-AgHBs) 2. Analyse et normalisation des surnageants 3. Inoculation de cellules sensibles HepaRG ou de cultures primaires dhépatocytes humains 4. Recherche dARN HDV ou dARNm HBV dans les cellules inoculées Extérieur Membrane virale Domaine dattachement Domaine matrice HBV (topologie interne) TLM

44 Mutants pre-S Extérieur Membrane virale DA DM TLM

45 Production des virions HDV Les mutations sont permissives pour la production de virions HDV. Extérieur DA DM TLM 110

46 Les résidus 11 à 75 sont impliqués dans linfectiosité HDV. Les résidus 76 à 110 (contenant le DM) ne sont pas impliqués dans linfectiosité HDV. Extérieur DA DM TLM 110 Le domaine pre-S1 contient-il des déterminants dentrée virale HDV ? (cellules HepaRG)

47 La suppression du TLM est-elle délétère à lentrée virale ? (HDV/HepaRG/PEG) La suppression du TLM nest pas délétère pour linfection en présence de PEG. Le PEG a t-il compensé une perte de fonction TLM? Extérieur DA DM TLM

48 La suppression du TLM nest pas délétère pour linfection en absence de PEG. Extérieur DA DM TLM La suppression du TLM est-elle délétère à lentrée virale en absence de PEG ? (HDV/HepaRG)

49 La suppression du TLM nest pas délétère pour linfectiosité HDV en culture primaire dhépatocytes. Extérieur DA DM TLM Le TLM est-il nécessaire à lentrée virale en culture primaire dhépatocytes ?

50 La suppression du TLM nest pas délétère pour linfectiosité HBV en culture de cellule HepaRG. Extérieur DA DM TLM La suppression du TLM est-elle délétère à lentrée virale dans le modèle HBV ? (HepaRG)

51 La taille des délétions semble influencer linfectiosité : nécessité dune distance minimale entre le domaine dattachement au récepteur (DA) et le DTM-I ? DTM-I Quelles sont les conséquences de grandes délétions pre-S sur linfectiosité des virions ? (HDV/HepaRG) DA

52 Conclusion 2 Les déterminants dinfectiosité du domaine pre-S de la grande protéine denveloppe sont confinés aux 75 premiers résidus N-terminaux. Les déterminants dinfectiosité du domaine pre-S de la grande protéine denveloppe sont confinés aux 75 premiers résidus N-terminaux. Une distance minimale semble requise entre le DTM I et le site dattachement au récepteur. Une distance minimale semble requise entre le DTM I et le site dattachement au récepteur. Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse.

53 Conclusion générale

54 Maturation HBV: Maturation HBV: S-AgHBs assure le bourgeonnement. S-AgHBs assure le bourgeonnement. L-AgHBs permet le recrutement de la nucléocapside (Domaine matrice). L-AgHBs permet le recrutement de la nucléocapside (Domaine matrice). Pas de rôle des BCY-I et –II dans le recrutement de la capside. Maturation HDV: Maturation HDV: S-AgHBs assure le bourgeonnement et possède un domaine matrice présent dans la BCY-II. S-AgHBs assure le bourgeonnement et possède un domaine matrice présent dans la BCY-II. Pas de rôle de la BCY-I. Infectiosité: Infectiosité: déterminants communs entre HBV et HDV sur pre-S1 (75 premiers résidus N-terminaux). déterminants communs entre HBV et HDV sur pre-S1 (75 premiers résidus N-terminaux). Pas de rôle des BCY-I et II, TLM, et DM.

55 Modèle dentrée virale 1.Attachement au récepteur résidus 1 à 48 (nécessité distance minimale avec DTM-I ?) Gripon, p., et coll. (2005). J virol 79, Barrera, A., et coll. (2005). J virol 79, Engelke, M., et coll. (2006). Hepatology 43, stabilisé par les résidus 49 à 75 ? Le Seyec, J., et coll. (1999). J virol 73, Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse. 2.Endocytose 3.Echappement des endosomes indépendante du pH Hagelstein, J., et coll. (1997). Virology 229, pas de fonction du TLM Blanchet, M., et Sureau, C. (2007). J virol, sous presse. Contrairement à Stoeckl, L., et coll. (2006). PNAS 103, peptide fusion dans le DTM-I ? Grcacic, E., et coll. (2000). J virol 74, Etude en cours au laboratoire intervention des résidus 49 à 75 ? isomérisation des ponts S-S de la BAG ? Jaoude, G. A., et Sureau, C. (2005). J virol 79,

56 Perspectives

57 Perspectives Identification du récepteur Identification du récepteur Préciser la fonction des résidus 49 à 75 de pre-S1 Préciser la fonction des résidus 49 à 75 de pre-S1 Préciser la fonction de la BAG Préciser la fonction de la BAG Vérifier la transposabilité à HBV Vérifier la transposabilité à HBV Les Trp de la BCY-II: Les Trp de la BCY-II: sont conservés parmi les Orthohepadnavirus sont conservés parmi les Orthohepadnavirus nont pas de fonction à lentrée virale nont pas de fonction à lentrée virale nont pas de fonction dans la maturation HBV nont pas de fonction dans la maturation HBV leur conservation est-elle imposée par lORF P ? leur conservation est-elle imposée par lORF P ?

58 Laboratoire de virologie moléculaire - INTS Georges Abou-Jaoudé Isabelle Komla-Soukha Jessica Salisse Camille Sureau Laboratoire de Virologie transfusionnelle - INTS Rémi Caparros Inserm U271 Christian Trépo Olivier Hantz


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