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Introduction aux puces à ADN Vincent BARRA ISIMA / LIMOS UMR CNRS 6158 Campus des Cézeaux 63177 AUBIERE www.isima.fr/vbarra.

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1 Introduction aux puces à ADN Vincent BARRA ISIMA / LIMOS UMR CNRS 6158 Campus des Cézeaux AUBIERE

2 2 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications –détermination des familles de gènes co-régulés, –recherche de systèmes de régulation, … Domaines –Pharmacologie –médecine –environnement… Mesure du niveau dexpression de plusieurs milliers de gènes simultanément Puces à ADN BiologieNanotechnologieChimieTraitement dimagesBioinformatique Introduction (1/3) Introduction

3 3 BiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Puces perles * * * * * GeneChip Affymetrix Puces ADNc Membrane Nylon SAGE Différentes Technologies CGH Agilent: Puces à jet dencre Introduction (2/3) Introduction

4 4 BiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Puces ADNc Principe : technique d'hybridation. Introduction (2/3) Introduction

5 5 BiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionIntroduction Eléments de biologie Les puces à ADN Analyse des données issues des puces à ADN De la cellule à lADN De lADN au génome Du génome au transcriptome Introduction (3/3) Principe Préparation du matériel biologique Acquisition dune image de puce à ADN Traitement dimages Analyse des données Quelques applications Etudes comparatives de transcriptomes Agriculture

6 6 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Eléments de biologie moléculaire Biologie

7 7 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion De la cellule à lADN Biologie

8 8 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Dogme central de la biologie moléculaire ADNARNProtéine Transcription Traduction Réplication Transcription inverse Biologie

9 9 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Elements de biologie moléculaire Biologie Transcription Traduction Synthèse de protéines ADN ARNm ARNt Acides aminés ARNm codon Membrane nucléaire Anticodon ARN polymérase Nucléotides ARN ARNr Ribosome Chaîne polypeptide

10 10 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Ribonucléotides libres Transcription Biologie

11 11 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Copie du gène en ARN = ARNm L'ARNm se détache et la molécule d'ADN se referme Transcription Biologie

12 12 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion La synthèse de la protéine (assemblage des acides aminés) se fait au niveau des ribosomes Biologie Traduction Pour synthétiser la protéine, il faut : ARNm = information (la recette) Ribosome = machine à assembler les acides aminés Acides aminés = pièces de construction ARNt (ARN de transfert) = molécules qui transportent les acides aminés du cytoplasme au ribosome où ils sont assemblés en protéine.

13 13 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Traduction Biologie

14 14 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion La maturation des protéines a lieu dans le Reticulum endoplasmique et l appareil de Golgi Modifications chimiques de la protéine (glycosylation, mérystylation, phosphorylation….) La maturation est indispensable à la fonctionnalité des protéines Biologie Hélice Feuillet Traduction

15 15 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion La protéine assemblée se replie pour former une structure tridimensionnelle précise Biologie Traduction

16 16 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Insuline Hémoglobine Biologie Traduction

17 17 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Acétylcholinestérase Hélices alpha Feuillets bêta Biologie Traduction

18 18 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines

19 19 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines

20 20 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines

21 21 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines

22 22 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines Anticorps IGE

23 23 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines

24 24 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion 1. Structure 2. Régulation du métabolisme 3. Mouvement 4.Transport de molécules 5. Immunité 6. Transport membranaire 7. Métabolisme (les enzymes) Biologie Traduction Principales fonctions des protéines

25 25 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Dogme central de la biologie moléculaire ADNARNProtéine Transcription Traduction Réplication Transcription inverse Les puces à ADN permettent de mesurer globalement le niveau dexpression de lARNm Protéine Transcription Traduction Ribosome ADN ARNmARNrARNt Biologie

26 26 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Intérêts et applications Biologie Etude de la dynamique du transcriptome Recherche et action de médicaments Recherche de mutations Oncologie Environnement et agriculture …

27 27 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Les puces à ADN Puces

28 28 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionPuces Etapes dune expérience utilisant des puces à ADN

29 29 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionPuces Etude de cas On cherche à déterminer les gènes dun organisme activés ou réprimés en conditions particulières On suppose disposes de deux types de cellules pour cet organisme : des cellules de contrôle des cellules représentative du phénomène étudié (pathologie, cycle cellulaire, stress hydrique, stress anaérobique,…) Exemple : croissance dune levure en conditions aérobie/anaérobie Utilisation courante des puces à ADN

30 30 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionPuces Préparation des cibles (1/2) On laisse croître les cellules dans les deux conditions Ajustement des transcriptomes pour survivre Centrifugation On purifie On isole les ARNm Tampon d'extraction On dilue On facilite lextraction

31 31 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionPuces Préparation des cibles (2/2) On ôte lARNm et on le place dans des nouveaux tubes Mélange La soupe est prête ! Conversion ARNm/ADNc Marquage R/V

32 32 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Préparation des sondes On dépose des milliers de séquence dADNc (sondes) sur un support de verre de petite taille. –Les sondes doivent être spécifiques dun gène –Chaque dépôt est la transcription inverse dun ARNm que lon souhaite mesurer Puces Les sondes sont déposées par un robot spotteur 70 mm 20 mm

33 33 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Hybridation Puces Hybridation

34 34 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Acquisition de limage de puce (1/3) Acquisition à laide dun scanner deux couleurs : détection différentielle de la fluorescence des cibles aérobies/anaérobies présentes sur le support Amplification du signal par des tubes photomultiplicateurs Construction dune image en fausses couleurs Puces

35 35 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Acquisition de limage de puce (2/3) Exemple Excitation laser vert Excitation laser rouge Puces

36 36 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Acquisition de limage de puce (2/3) Exemple Gène aérobique Gène anaérobique Gène exprimé dans les deux conditions Puces

37 37 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Acquisition de limage de puce (3/3) Puces

38 38 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionPuces Schéma récapitulatif Puce à ADN excitation laser 1 laser 2 émission Tableau N*P Analyse et normalisation dimages Hybridation Sondes

39 39 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Analyse des données Analyse

40 40 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Analyse des données Adressage Segmentation Quantification Extraction de connaissances Impact consid é rable sur l interpr é tation biologique des donn é es Analyse

41 41 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Queues de comètes Débordement des puits Mauvais rapport S/B Superpositon –Segmentation signal/fond et débruitage –Extraction et normalisation de linformation –Recherche des centres de spots Problèmes : Traitement dimages Analyse

42 42 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionAnalyse Traitement dimages Localisation des spots Méthodes algorithmiquesMéthodes géométriques

43 43 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionAnalyse Traitement dimages Extraction des gènes dintérêt Quels sont les gènes dont la variation dintensité est significative ? Analyse de données/extraction de connaissances Quantification Intensités en rouge et vert Intensités en rouge et vert corrigées du bruit de fond …

44 44 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionAnalyse Analyse de données Objectifs A partir de la liste des gènes ayant une variation significatives par rapport à lexpérience : Trouver les gènes ayant une variation recherchée Regrouper les gènes ayant des variations similaires Trouver les gènes expliquant les variations dautres gènes

45 45 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Classification hiérarchique : –Calcul dune matrice de similarité entre gènes –Regroupement des deux gènes les plus proches –Remplacement des deux gènes par un gène moyen –Processus itératif Construction dun arbre phylogénique représentant une hiérarchie de groupes de gènes Une des premières méthodes utilisées Analyse de données Analyse

46 46 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Analyse de données Exemple : Extrait du génome de la levure du boulanger Saccharomyces cerevisiae Clustering hiérarchique Analyse

47 47 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Algorithme des nuées dynamiques Analyse de données InitialisationClassification Mise à jour des centres Analyse

48 48 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Réseaux de neurones 8 groupes stables 8 groupes stables Analyse de données Analyse

49 49 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusionAnalyse Représentation des données Problèmes –Visualiser les résultats de lanalyse du transcriptome à léchelle du génome entier –Intégrer les résultats pour répondre aux interrogations. Deux types de méthodes –Organisation de la liste des gènes visualisation des résultats –Représentations quantitatives vue globale de leffet des expériences

50 50 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Tableau résumant les expressions de chaque gène Représentation en fausses couleurs Induction du gène par une échelle (noir/rouge) Répression du gène par une échelle (noir/vert) Peu lisible Pas dinclusion des intensités + intensité moyenne des gènes + éléments cis régulateurs dans les promoteurs Représentation des données Analyse

51 51 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Localisation chromosomique des gènes Localisation chromosomique des gènes Analyse Représentation des données Graphique mettant en valeur leffet observé à léchelle du génome

52 52 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Utilisation de méthodes issues du data mining : exemple de la mise en évidence de relations entre objets Calcul de similarités Réseau de points Carte stable Exemple dapplication Carte aléatoire Analyse Représentation des données

53 53 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Incorporation dautres informations –Fonctionnelles (banques de données) –Expertes (biologistes..) Comparaison des résultats obtenus avec ce qui est déjà connu Analyse Représentation des données

54 54 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Quelques applications Applications

55 55 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN Applications

56 56 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes Applications Le transcriptome = population des ARNm exprimés par un organisme à un instant donné. résulte dun équilibre entre la synthèse et la dégradation des ARNm varie en fonction des conditions intra- et extra-cellulaires. offre une représentation dynamique de létat de la cellule et des processus biologiques en cours. Lanalyse du transcriptome permet détablir le « profil dexpression » de chaque gène considéré, cest-à-dire la variation de son niveau dexpression selon un ou plusieurs paramètres (temps, type cellulaire, etc.).

57 57 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes Applications De nombreuses études ont été réalisées dans différents organismes afin didentifier les gènes co-régulés dans certaines réponses cellulaires spécifiques. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, études de la variation transcriptionnelle des gènes : au cours du cycle cellulaire mitotique au cours de la méiose et de la sporulation en réponse à la transition de la fermentation anaérobie à la respiration en réponse aux lésions de lADN provoquées par des irradiations ou des agents génotoxiques etc.

58 58 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes Applications La comparaison de divers transcriptomes de mutants, de types cellulaires ou de tissus donnés permet également de prédire la fonction de gènes non caractérisés et délucider des réseaux de régulation de voies biochimiques complexes. lanalyse du transcriptome permettant de caractériser létat de la cellule, lutilisation de puces à ADN dans un objectif de diagnostic est en développement. distinguer des types de cancers non différentiables par dautres méthodes recherche et la validation de substances thérapeutiques en permettant lidentification de nouveaux gènes cibles et la caractérisation de la réponse cellulaire à un traitement.

59 59 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN – études comparatives de transcriptomes Applications Analyse de mutations : cribler des gènes caractérisés par leur polymorphisme. La diversité génétique dune population peut être explorée et la relation entre le génotype et le phénotype, de gènes et de groupes de gènes peuvent ainsi être mis à jour. Analyse des mutations des gènes codant pour deux enzymes du virus du SIDA (Gen-Chip HIV, Affymetrix) détection des mutations génétiques liées à certains cancers du colon et du sein (Leti, Grenoble) détection des mutations de lexon 11 du gène BRCA1, responsable du cancer héréditaire du sein et de lovaire (Hacia et al, Affymetrix) …

60 60 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN – agriculture Genoplante Programme fédérateur de génomique végétale qui associe en France la recherche publique (INRA, CIRAD, IRD, CNRS) et les principales sociétés privées impliquées dans l'amélioration et la protection des cultures ( Biogemma, Bayer Cropscience, Bioplante). Objectifs Découvrir des gènes utiles : amélioration des plantes raisonnée et découverte de nouvelles molécules agro-chimiques plus respectueuses de l'environnement. Etude des espèces "modèles : étude d'Arabidopsis et du riz permettra pour avancer dans la connaissance des autres plantes cultivées. Exemple Détermination des processus biologiques et moléculaires améliorant la tolérance au froid du blé Applications

61 61 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Applications des puces à ADN – agriculture Applications Leader, Journal of Cereal Science, 41, pp , 2005 Etude des gènes activés après bourgeonnement

62 62 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Il est maintenant possible danalyser lexpression de milliers de gènes en parallèle et à haut débit. Révolution technologique Changement déchelle de la recherche biologique Domaine plurisiciplinaire Applications multiples Conclusion

63 63 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Quel avenir pour les biopuces ? Les possibilités des puces à ADN sont inversement proportionnelles à leurs tailles. ARN artificiels capables de remplacer des anticorps monoclonaux Accès aux immuno-analyses simultanées du même prélèvement pour le diagnostic moléculaire des maladies infectieuses la recherche sur les résistances aux antibiotiques. Mise au point imminente de puces de polymorphismes dont les applications seront des plus nombreuses: Etude de la diversité génétique dans le cadre de la génétique des populations Etablissement de cartes génétiques affinées Recherche accélérée sur les maladies à origine génétique (dépistage, facteurs de risque...)

64 64 IntroductionBiologiePucesAnalyseApplicationsConclusion Et bientôt…la transformation des puces en laboratoires (CEA) Dépôt de léchantillonPuce à ADN Détection, en moins d'une heure, les agents infectieux présents dans un échantillon de sang ou de salive Détection de l'éventuelle présence d'une trentaine de micro-organismes en même temps Traitement de léchantillon


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