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Présenté par: - Nathalie ROUSSEAU -Sarah MERAD -Adiza SEYDOU Master MICROBIOLOGIE, ECOLOGIE Parcours Recherche « Ecologie Microbienne » Université Claude.

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1 Présenté par: - Nathalie ROUSSEAU -Sarah MERAD -Adiza SEYDOU Master MICROBIOLOGIE, ECOLOGIE Parcours Recherche « Ecologie Microbienne » Université Claude Bernard Lyon 1 Secrétariat : Batiment G.Mendel- 4éme étage 43 boulevard du 11 novembre VILLEURBANNE CEDEX Tél : Fax : Courriel : master2.

2 Introduction Haemophilus ducreyi (bacille de Ducrey) coccobacille, Gram – sexuellement transmissible chancre mou facteur favorisant la pénétration et transmission de VIH  Ulcérations génitales  Prostituées  Hommes++++  Femmes ++

3 Introduction Objectif Identifier in-vivo les facteurs de virulence responsables de la formation d'ulcères exprimés dans le génome d’H. ducreyi par technique STM.

4 Matériels et méthodes  Souches utilisées: Haemophilus ducreyi sauvage 35000HP H. ducreyi transformée électroporation E-coli TOP10: cellule hôte clonage  Modèle animal: TDRM Temperature-dependent rabbit model

5 Matériels et méthodes Signature-Tagged Mutagenesis -STM- méthode de sélection négative But : détecter les gènes de virulence (ou gènes indispensables à l’infection) dans le génome bactérien Technique : Inactivation aléatoire de gènes grâce à des transposons Comparaison in vitro/in vivo des souches sauvages et mutantes

6 Matériels et méthodes Principe général

7 Matériels et méthodes Construction des STM Construction du STM contrôle positif Obtention des souches mutantes d’ H. ducreyi (pool de mutants) Inoculation à l’animal Comparaison « input » - « output » : PCR

8 Clonage dans E.coli TOP 10

9 Matériels et méthodes  Obtention des souches mutantes d’ H. ducreyi Incorporation des plasmides construits dans H. ducreyi par électroporation ○ Insertion unique et aléatoire des transposons + tag dans génome bactérien  « Bibliothèques » de mutants : # 500 mutants  Mise en culture Sélection des souches mutantes de croissance rapide (essais de compétition) : pool « input » = pool in vitro  Inoculation à l’animal  pool « output » = pool in vivo

10 Inoculation à l’animal et comparaison des pool input et ouput

11 Résultats et discussion Gènes virulents :  hgbA (contrôle positif)  hicB Gènes associés à une faible virulence :  dnaK  tdhA

12 Conclusion Les gènes responsables de la pathogenèse d’H. ducreyi peuvent servir de cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du chancre mou.

13 Merci pour votre attention


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