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GMP 2004 J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5 Inserm Institut national de la santé et de la recherche médicale  Le point.

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1 GMP 2004 J.M.SCHERRMANN INSERM U26 et CPPK département - Université Paris 5 Inserm Institut national de la santé et de la recherche médicale  Le point sur les transporteurs et leur impact dans le développement cinétique du médicament

2 GMP 2004 TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUE ETAT DES CONNAISSANCES EN 1987 Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987 "Drug transport in the intestine occurs mainly by diffusion".... " Intestinal drugs carriers contribution seems to be of minor importance." "The liver is the organ where carrier-mediated drug transport predominates" Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, octobre 1998, Paris

3 GMP 2004 TRANSPORTEURS ET PHARMACOCINETIQUE ETAT DES CONNAISSANCES EN 1987 Michael SCHWENK : Review, Drug Transport in intestine liver and kidney. Arch. Toxicol. 60, 37, 1987 Four hypothetical carrier systems for hepatocellular drug uptake Carrier 1 Carrier 2 Carrier3 Carrier4 Bile acids Estronesulfate Estradiol glucuronide Bilirubin Bromosulphophtalein ANS Indocyanine green Morphine Nalorphine Ouabain Rôle des mécanismes de transport en ADME et stratégies d’étude en phase préclinique, GMP, octobre 1998, Paris "bile acid carrier""organic anions" "organic cations"

4 GMP 2004 TRANSPORTEURS ET ADME EN 1996 A. TSUJI, Carrier-mediated Intestinal Transport of Drugs, Pharm. Res., 1996 PepT1 MCT1 MDR1 Absorption et sécrétion intestinales

5 GMP 2004 TRANSPORTEURS RENAUX EN 1997 K.j. ULLRICH, Renal transporters for organic anions and organic cations, J. Membrane Biol, 1997 MDR1 Oatp1 MRP OCT1 Sécrétion et réabsorption rénales

6 GMP 2004 TRANSPORTEURS HEPATIQUES EN 1997 D. K. MEIJER, Adv. Drug Deliv. Rev., 1997 Métabolisme et excrétion biliaire

7 GMP 2004 Le transport en 2004 ?

8 GMP 2004 Vers l’identification et la cartographie cellulaire des protéines de transport impliquées dans ADME et de nombreuses questions sur leur rôle fonctionnel et leur impact sur les stratégies de développement du médicament Vers la vectorisation des processus cinétiques de ADME

9 GMP 2004 ENZYMES/TRANSPORTEURS : SIMILITUDES  Protéines  Expression ubiquitaire  Inhibition (domaine des Km, Ki du nM au mM)  Induction (voies de transcription communes : PXR, CAR, FXR…)  Polymorphismes Génétiques (CYP 3A –ABCB1 (P-gp))  Polyspécificité des substrats transformés ou transportés

10 GMP 2004 Exon 26C 3435 T C 3435 T    mutation silencieuse Polymorphisme génétique de la P-gp

11 GMP 2004 Polymorphisme génétique de la P-gp : effets sur l’absorption intestinale de la digoxine C D - TT > C D - CC AUC TT > AUC CC 38% En relation avec  niveau expression P-gp des entérocytes (barrière intestinale) –TT : faible niveau d’expression –CC : fort niveau d’expression Extrait de Hoffmeyer et al., 2000

12 GMP 2004 Polyspécificité des substrats transportés Cations organiques amphiphatiques ABCB1, ABCC1, ABCG2 Substrats communs entre ABC protéines vbl dox col pra ABCB1 ABCG2 ABCC1 From LITMAN et al. CMLS 2001

13 GMP 2004 Le tandem cinétique enzyme - transporteur Déterminisme ou Stochastisme ? MM-OH M-OC M Phase 0Phase 1 Phase 2Phase 3 T UGTsCYPs ex : couplage CY3A / P-gp au niveau intestinal régulation coordonnée des gènes ? T

14 GMP 2004 ENZYMES/TRANSPORTEURS : DIFFERENCES ENZYMESTRANSPORTEURS fonctionbiotransformation chimiquetransport expression cellulaire organites intracellulaires membranes plasmique, mitochondriale, nucléaire co-facteurs de la réaction NADPH, Fe,… ATP, GSH, H +,

15 GMP 2004 Polarisation de l’expression des transporteurs sur les cellules épithéliales et endothéliales MDR1 P-gp MDR3 P-gp MRP1cMOAT (MRP2) MDR 3 Application du concept dans les modèles in vitro Pôle apical Pôle basal

16 GMP – UNE TRENTAINE DE TRANSPORTEURS D’INTERET EN ADME REINBARRIERES : BHE, placenta, prostate INTESTIN PROTEINES ABC (7) Pep T 1/2 MCT 1/2 OCTs (5) OATs (4) OATPs (9) FOIE ENTs (8) BEAUCOUP D’AUTRES IMPLIQUES EN PK-PD ex : bioamines cérébrales (sérotonine, dopamine……) polymorphisme génétique du transporteur 5 HTT

17 GMP 2004 NomsABC1MDR P-gp MRPALDOABPGCN20White BCRP Sous- familles ABCAABCBABCCABCDABCEABCFABCG Membres (+1?) 49 transporteurs ATP – Binding Cassette chez l’Homme La super famille des protéines ABC Transport actif primaire uniport théorie « flippase », « vacuum cleaner »(P-gp) co-transport avec GSH (MRPs)

18 GMP 2004 MRPs : ABCCs MRP1 MRP5 MRP9 Intracellulaire NH2 ATP NH2 D’après Borst et al.(2000) et Bera et al.(2002) extra intra MRP1: 190kDa. 930 (MRP9) à 1545 aa (MRP2). Transporteurs ABC Dépendent du GSH (co- transport) Inhibiteurs : Probénécide, indométacine, MK571 Substrats : composés anioniques, conjugués au glutathion, aux sulfates et à l’acide D- glucuronique. Ex: leucotriène C4, oestradiol- 17-  -D-glucuronide.

19 GMP superfamille « membrane solute carrier », famille SLC21A/slc21a - transport actif secondaire (GSH, anions inorganiques) - rat /souris / homme : 11/8/9 représentants caractérisés à 722 aa., 12 TDMs N-glyc Signature de la famille Substrats : anions organiques de PM >450Da. ex: sels biliaires, DHEA, digoxine, taurocholate, agonistes des récepteurs opioïdes  (DPDPE)… Inhibiteurs : digoxine, PSC833, probénécide. Transporteurs d’anions organiques polypeptides : OATPs/oatps (SLC21A) La super famille des protéines SLC

20 GMP Transport actif secondaire - 4 représentants caractérisés (OAT1 à OAT4) - Distribution tissulaire : rein et foie - Cerveau : BHE BHE : OAT3 sur la membrane luminale des cellules endothéliales BHL BHL : OAT1 et OAT3 sur la membrane apicale des cellules épithéliales des PC D’après sweet et al., Substrats : acide p-aminohippurique, céphalosporines, AINS, fluorescéine, pesticides, herbicides. - Inhibiteur : probénécide Transporteurs d’anions organiques : OATs(SLC22A) La super famille des protéines SLC

21 GMP 2004 Transporteurs des cations organiques : OCTs (SLC22A) La super famille des protéines SLC D’après Koepsell, 1998 transport actif secondaire potentiel dépendant : OCT1, OCT2, OCT3, + H dépendant : OCTN1, OCTN2 distribution : rein et foie intestin, cœur, cerveau, placenta substrats : amines endogènes (acétylcholine, choline, dopamine, épinéphrine…) cimétidine, morphine, vérapamil, quinine, quinidine, paraquat

22 GMP 2004 Vers le savoir…

23 GMP 2004 Expression et régulation de quatre transporteurs ABC impliqués dans les mécanismes de multirésistance médicamenteuse, P-gp, Mrp1, Mrp5 et Mxr, chez les rongeurs: le modèle astrocytaire. La MRP1 ou l’ABCC1 NBD1NBD2TMD0TMD1TMD2 Claire Mercier, Doctorat de l’Université Paris5, 9 décembre 2003 Expression dans des organes pluricellulaires exemple : cerveau et protéines ABC

24 GMP 2004 Expression de la Mrp1 sur les barrières cérébrales chez le rat adulte Ependyme, Astrocytes ss ép. Méninges Glie limitante Plexus choroïdes Ependyme Cap M M CP Ep V F1 CP V  Ep V V Cap BHE Mrp1 GFAP Expression dans des organes pluricellulaires exemple : cerveau et protéines ABC C. Mercier et al, Brain Res. (soumis)

25 GMP 2004 BHE Plexus choroïdes Ventricule Méninges Neurone Astrocyte Ependyme Parenchyme cérébral Astrocyte Mrp1 Abcg2 P-gp Mrp5 Expression dans des organes pluricellulaires exemple : cerveau et protéines ABC

26 GMP 2004 JONCTION SERREE PERICYTE ASTROCYTE NEURONE CELLULE ENDOTHELIALE Membrane basale SANG Pgp Mrp1 Induction des protéines de transport exemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC

27 GMP 2004 PUR et DOX provoquent : transcription du gène mdr1b de manière dose- et temps-dépendante GPNT contrôle 4 h h24 h48 h A GAPDH ARNm mdr1b B h w P-gp HL60 contrôle 4 h 12 h 24 h 48 h Effets de la puromycine sur l’expression de mdr1b dans les cellules endothéliales RBE4 P. Demeuse, J. Neurochem., 2004 Effet de la doxorubicine sur l’expression de mdr1b chez l’astrocyte de rat C. Mercier, J. Neurochem., 2003 Induction des protéines de transport exemple : barrière hémato-encéphalique et protéines ABC

28 GMP 2004 Régulation de l’expression de la P-gp dans les astrocytes de rat Activité fonctionnelle, 24 h d’exposition à la vincristine contrôle50 ng/mL 500 ng/mL contrôle PSC833 ** *** P-gp fonctionnelle et inhibée par PSC833. Corrélation entre l’expression des ARNm, de la protéine et de la fonctionnalité. C. Mercier, J. Neurochem., 2003

29 GMP 2004 Fanchon Bourasset, Doctorat de l’Université Paris5, 17 décembre 2003 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Implication des transporteurs d’influx et d’efflux dans la neuropharmacocinétique des xénobiotiques cavéoline La P-gp ou l’ABCB1

30 GMP 2004 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Problématique : pourquoi l’activité analgésique du morphine-6 glucuronide (M6G) est supérieure à celle de la morphine alors que sa perméabilité membranaire est dix fois plus faible ? Données bibliographiques :  Inhibition du passage de la BHE par le PSC 833 et le vérapamil (BBB in vitro, Huwyler, 96, 98; in vivo, Lötsch, 02)  Effet analgésique identique entre mdr 1a (-/-) et mdr 1a (+/+) pour le M6G (Lötsch, 00) mais différent pour la morphine (Thompson, 00)

31 GMP 2004 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G 1.Rôle de la P-gp dans le passage de la BHE du M6G 1.Rôle de la P-gp dans le passage de la BHE du M6G : souris sauvages / déficientes en P-gp (mdr1a (-/-)), +/- digoxine, PSC833 2.Rôle de transporteurs d’anions organiques - Mrp1 (souris sauvages / mrp1 (-/-)) - oatps, souris sauvages +/- digoxine, PSC833 3.Rôle de GLUT-1 Hypothèses testées par la méthode de perfusion cérébrale in situ

32 GMP , ,0001 0,001 0,01 0, , ,00010, P/MM 1/2 Kin(µl/g/s) Kin expérimentalKin prédit D-glc M6G TXD258 vinblastine vincristine diazépam morphine S18986 imipramine sucrose Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G

33 GMP 2004 Na + GLUT 1 LAT 1 A, B 0+ ASC NUTRIMENTS SANG CERVEAU CATIONS ORGANIQUES membrane abluminale membrane luminale P-gp ATP OCT? ANIONS ORGANIQUES OATP A oatp 2 MCT1 OAT ? Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G

34 GMP 2004 P-gp non impliquée Mrp1 non impliquée GLUT-1 Transporteur sensible à la digoxine et PSC833: oatp2? Transporteur sensible à la digoxine et PSC833 : oatp2? Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G Transport du M6G à travers la BHE par: F. Bourasset et al, J. Neurochem, 2003

35 GMP 2004 GLUT 1 SANG CERVEAU membrane abluminale membrane luminale P-gp ATP OATP A oatp 2 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par le M6G X

36 GMP 2004 SANG CERVEAU membrane abluminale membrane luminale P-gp ATP OATP A oatp 2 Multiplicité des transporteurs et inhibition croisée exemple : passage de la BHE par la digoxine et les enképhalines (DPDPE) PSC 833

37 Etudes fonctionnelles de protéines ABC ( P-glycoprotéine, Mrp1, Bcrp) au niveau de la barrière hémato-encéphalique chez les rongeurs Salvatore Cisternino, Doctorat de l’Université Paris5, 19 décembre 2003 Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo) TMDNBD OUT IN La MXR ou l’ABCG2 GMP 2004

38 La perfusion cérébrale in situ Isole le cerveau /organisme Parfait contrôle du milieu de perfusion Sensible Simple Possibilité de vérification de l’intégrité de la BHE Applications: Rat (Takasato et coll., 1984) Souris (Dagenais et coll., 2000) 1 On 2 Off Saccharose* + molécule étudiée * Tampon physiologique GMP 2004

39 Mesure du transport cérébral en trans-influx zéro : Souris Mrp1(-/-) vs. Souris sauvagesmrp1(+/+) mrp1(-/-) Pas d’effet de la Mrp1 sur le transport cérébral de ces molécules (idem 99m Tc-Sestamibi; Cattelotte et coll.,2004 ) (S. Cisternino et al, Pharm. Res., 2003) GMP 2004

40 ESPACE VASCULAIRE PARENCHYME CEREBRAL (P-gp) ATP Membrane abluminale Membrane luminale ABCB1 (MRP 1) ATP ABCC1 Influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral au niveau de la BHE chez la souris ATP ? (BCRP) ABCG2 Eisenblatter et coll., 2002; 2003 Cooray et coll., 2002 Zhang et coll., 2003 X

41 GMP 2004 La BCRP (ABCG2 ou MXR) Structure: 72 Kda (monomère) protéine ABC sous famille G 6 segments, 1 TMD, 1 NBD Homodimérisation Phénotype MDR Localisation: Physiologique et tumorale rein, intestin, placenta, BHE Subcellulaire: Apicale co-localisation avec la P-gp (polarisé) BHE In vitro : cellules endothéliales de porc, homme In vivo : pas de données Substrats: Mitoxantrone, prazosine, SN38, 3TC Modulateurs: GF120918, Fumitrémorgine C Étude menée in vivo pour déterminer l’influence de l’Abcg2 sur le transport cérébral

42 GMP 2004 Souris : Sauvage & Mdr1a(-/-) Composés : [ 3 H]Mitoxantrone [ 3 H]Prazosine [ 3 H]Vinblastine [ 14 C]Sucrose GF PSC833 Methodologie : Perfusion cérébrale in situ chez la souris Mesure du transport cérébral: Substrat mixte P-gp/Bcrp: [ 3 H]-Mitoxantrone (MX) [ 3 H]-Prazosine Non substrat de la Bcrp: [ 3 H]-Vinblastine Influence de la P-gp : -comparaison sauvage / Mdr1a(-/-) -PSC833 (modulateur de la P-gp) Influence de la Bcrp : - GF (modulateur mixte Bcrp/P-gp)

43 GMP 2004 Méthodologie : Etude de biologie moléculaire Déplétion Capillaire (Triguero et coll., 1990): 1.Perfusion cérébrale in situ avec un tampon (rincer le cerveau du sang) 2.Déplétion – homogénéisation mécanique–centrifugation 3.Culot (capillaires cérébraux) souris sauvage / mdr1a(-/-) RT-PCR quantitative en temps réel (cortex; capillaire cérébral) : abcg2 ARNm gapdh ARNm (référence) Spécificité (gel d’agarose, courbe de dissociation)

44 GMP 2004 Étude du transport cérébral de la [ 3 H]-prazosine chez la souris souris sauvage souris mdr1a(-/-) *****†† [ 3 H]-Prazosine K in (µl s g ) 0 Témoins PSC833 (3 µM) GF (2 µM) *** Prazosine (30 µM) Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de prazosine Efflux indépendant de la P-gp (GF120918, prazosine), surexpression ?

45 GMP 2004 Étude du transport cérébral de la [ 3 H]-mitoxantrone chez la souris TémoinsMX 100 µM [H 3 ]-Mitoxantrone K in (µl s g ) Souris sauvage Souris mdr1a(-/-) †† *** †† PSC833 (3 µM) GF (2 µM) Pas d’effet de la P-gp sur le transport cérébral de MX Efflux indépendant de la P-gp (GF120918), surexpression ?

46 GMP 2004 Transcrits d’abcg2 dans le cortex et les capillaires du cerveau de souris par Q-RT-PCR abcg2 ARNm gapdh sauvage mdr1a (-/-) Cortex cérébral 1.0  0.2 ND Fractions de Capillaires cérébraux 680   200 Enrichissement d’abcg2 au niveau des capillaires cérébraux Compensation de mdr1a par l’abcg2

47 GMP ) Ce transport n’est pas sensible au PSC833 (pas d’effet sur la Bcrp) 5) Abcg2 est surexprimée au niveau des capillaires de souris mutantes mdr1a(-/-) 1)GF inhibe un transporteur d’efflux autre que la P-gp et impliqué dans le transport de la MX et de la PRA 2) Inhibition par le GF est plus forte pour les souris mdr1a(-/-) que pour les souris sauvages pour le transport de MX et de PRA 4) RT-PCR confirme la présence et l’enrichissement des transcrits d’abcg2 au niveau du capillaire cérébral Conclusions

48 GMP 2004 Synergie entre ABC protéines et physiopathologies Progressive Familial Intrahepatic Cholestasis (PFIC type 3) PFIC Type 2 (MDR 1, PGP) B 1 (MRP 2) C2 DUBIN-JOHNSON SYNDROME G5/G8 Bilirubine Conjugates and Drugs B 11 ( BSEP) B 3 (MDR 3) Phospholipids SITOSTEROLEMIA PMG and MDR Bile salts Cholesterol Micelles Drugs Canalicule biliaire

49 GMP 2004 Corrélation inter-modèles (in vitro, in situ, in vivo) Quel modèle d’étude du transport ? A quel stade du développement ? Quelle réponse? modèlesstade de développementréponses Systèmes transfectés précoce (HTS) substrat O/N inhibiteur O/N, a Monocouches cellulaires précoce ( ± HTS) polarisation du transport, a Tissus, organes isolés In situ candidat sélectionné impact sur A/M ou D/M ou E/M, a Animal entiercandidat sélectionné Impact sur ADME a) Possibilité de déterminer les paramètres cinétiques (Vmax, K T …)

50 GMP 2004 Synergie entre modèles vitro-vivo Pharmacocinétique des systèmes intégrés et physiopathologiques Pharmacocinétique moléculaire et cellulaire Vers le futur …

51 GMP 2004 Remerciements C. Mercier, F. Bourasset, S. Cisternino, E. Niel


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